染色體雙熒光顯帶鑒定啤酒花雌雄株及其在生物學實驗教學中的應用

陳春麗, 馮燕妮, 黃 濤

(華中農業大學 生命科學技術學院， 武漢 430070)

染色體顯帶技術(chromosome banding technique)是一項通過顯帶染色等處理分辨出染色體更微細的特征，如帶的位置、寬度和深淺等的技術。常見染色方法有喹吖因熒光染色技術、Giemsa染色技術等[1]。這些方法顯示的物種及染色體特異性熒光帶型，可以用來有效鑒別染色體和研究染色體的結構與功能[2-3]。隨著熒光染料的發現，熒光顯帶技術在染色體核型分析、性別鑒定等應用中日漸廣泛。常見核酸熒光染料主要有色霉素(chromomycin A3，CMA )、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI )、碘化丙啶(PI)及Hochest33258等。其中CMA為GC特異型熒光染料，DAPI為AT特異型熒光染料。Yamamoto等利用CMA與DAPI雙熒光染色法分析柑橘類植物的染色體帶型，有效鑒定了不同柑橘品種[4]。張揚等利用45S rDNA-FISH鑒定銀杏雌雄性別，表明銀杏性別決定與隨體染色體數有關[5]。

自然界中約4%被子植物是雌雄異株植物[6]，如常見的木本植物楊樹、柳樹、銀杏、柿等，草本植物菠菜、大麻、栝樓等。這些雌雄異株植物為研究植物的性別決定和進化提供了很好的實驗材料[7-8]。研究雌雄異株植物的染色體特征及性別決定，有利于進一步揭示性染色體起源和進化機制，同時對哺乳動物性別進化研究也具有重要參考意義[9-10]。由于不同性別的同種植株在生理形態、生物學特性和經濟價值等方面存在一定差距，所以在實際生產中，如林業生產、園藝事業以及果蔬種植，常常會根據經營目的從中選擇栽培某一種性別的植物，以獲得較好的經濟效益[11-12]。少數植物可以從植株的枝、葉、花等外部形態觀察識別雌雄株，或從同工酶、指示生理指標和新陳代謝的酸性和堿性磷酸酶活力等差異來鑒別雌雄株[13-15]，以及根據雌雄株代謝產物的不同用溴麝香草酚藍化學染色進行性別鑒別等[16]。但是多數雌雄異株植物幼齡期的外部形態沒有明顯的區別，其同工酶、磷酸酶活力和代謝產物差異也不顯著[17-18]，故早期區分雌雄株存在較大困難。因此，不論在理論價值上還是實踐意義中，對雌雄異株植物開展早期性別鑒定都非常重要。

啤酒花，學名HumuluslupulusL.，別名蛇麻草，葎草屬植物，雌雄異株，雌花穗狀，雄花圓錐花序。在啤酒釀造中所用均為雌花。因此，在生產中一般栽培經濟效益大的雌性啤酒花。染色體雙熒光染色法用于啤酒花苗期性別鑒定，簡單、快速，對指導啤酒花生產、啤酒花經濟產鏈的發展具有較好意義。啤酒花基因組大小為25.7 億堿基，染色體數目2n=20[19]，比較容易觀察。這些生物學特性使啤酒花成為染色體雙熒光顯帶鑒定植株性別的代表植物。將這一染色體熒光顯帶代表植物用于高校生物學實驗課程教學，可以使學生拓寬視野、開闊思路，培養學生綜合應用各科所學知識的能力，在實驗中激發和培養學生的創新和創造能力，也可以為高校生物學實驗課程改革提供新的實驗素材。

染色體熒光顯帶技術是認識染色體結構的重要方法，是在常規染色體計數方法基礎之上的提升，用于高校生物學實驗課程具有明顯優勢及很好可行性。其實驗操作步驟相對比較簡單，染色體計數是常規實驗，本實驗設計僅需在染色體計數實驗基礎上增加一步熒光染色即可。完成該實驗流程的周期短，只需6～8周。具體從取材到觀察實驗結果僅需8學時。得到實驗結果相對不難，但要得到高質量的實驗數據就需要學生有工匠般的實驗精神。在生物學實驗教學中增加此項內容，一方面可以推動實驗課程的更新，為植物生物學、植物顯微技術、遺傳學及細胞工程等課程的實驗教學改革提供新思路；另一方面，有助于培養學生的實踐動手能力和綜合實驗能力，使學生體會到植物生物學知識和染色體熒光顯帶技術的趣味性、實用性與先進性。

1 實驗原理

染色體的結構組成特點：細胞分裂時期，染色體濃縮，形成端粒、著絲粒，NOR(核仁組織區)等光鏡下可見的形態結構。按染色體狀態，可分為常染色質和異染色質。

熒光染料的特性：不同熒光染料可以分別結合在染色體不同結構區域，具有堿基特異性。常見核酸熒光染料主要有色霉素(CMA)、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI )、碘化丙啶(PI)等。其中CMA為GC堿基特異型熒光染料，在450 nm激發光下發出570 nm的黃色熒光；DAPI為AT堿基特異型熒光染料，在358 nm激發光下發出461 nm的藍色熒光。

2 教學設計與安排

2.1 教學目的

本實驗的教學目的主要包括3點內容：1)觀察啤酒花植物染色體形態結構；2)掌握植物染色體制片技術；3)掌握染色體熒光顯帶技術。

2.2 教學重點與難點

本實驗的教學重點和難點包括：1)教學重點，植物染色體的形態結構；2)教學難點，染色體制片。

2.3 實驗材料與設備

1)實驗材料：啤酒花植株根尖。2)實驗儀器及工具：體視顯微鏡、相差顯微鏡、帶數碼攝影系統的熒光顯微鏡、鑷子、解剖針、刀片。3)實驗試劑：果膠酶、纖維素酶、乙醇、冰乙酸、飽和對二氯苯、氯化鉀、色霉素(CMA)、DAPI。4)實驗耗材：載玻片、蓋玻片、濾紙、試劑瓶等。

2.4 教學安排

2.4.1 學時安排

本實驗共分為3個階段：1)啤酒花根尖材料準備；2)染色體制備；3)染色體熒光染色、觀察與記錄；4)實驗結果分析與討論。課上8學時，課前準備2學時，課后實驗結果分析討論2學時。

2.4.2 課前準備

啤酒花地下莖扦插或綠枝扦插生根(提前6～8周扦插繁殖)，實驗相關藥品配制等。

2.4.3 學生分組

建議實驗中每5人為1組。組員之間協調配合，共同合作完成實驗流程，共同分析實驗結果，整理實驗數據并積極參與討論。

3 實驗步驟

提前6～8周做好啤酒花植株繁殖準備。地下莖扦插法：取生長健壯、長12 cm左右、莖粗1.8 cm、兩端切口光滑的啤酒花地下莖作為種苗直接定植。綠枝扦插法：生長健壯的枝蔓截剪，經過消毒和生長調節劑處理后，直接插入苗床。

3.1 啤酒花植株根尖準備

第1天上午，用刀片截取旺盛生長的根尖 (1.5 mm)，置于含冰水混合物的2 mL小離心管中，4℃冰箱過夜。

固定：第2天上午，吸出小管中蒸餾水，0.075 mol/L KCl前低滲30 min(室溫)，換入新鮮配制的卡諾固定液(酒精∶冰乙酸=3∶1)固定。

3.2 染色體制備

將固定后的根尖充分水洗后，置于2%纖維素酶+2%果膠酶2∶1混合酶液中，28℃下酶解約3 h。加入蒸餾水，吸出酶液，0.075 mol/L KCl后低滲處理10 min。

吸取1個根尖于干凈預冷的載玻片上，滴半滴固定液，用鑷子敲至漿狀，滴2～3滴固定液使材料分散，火烤至著火。

10倍相差物鏡顯微鏡下鏡檢染色體制片，找出符合要求(每張至少10個染色體分散良好且背景干凈的分裂相)的制片備用。

3.3 熒光染色、照相及圖像分析

染色體制片雙熒光染料染色： 每片加含0.5 mg/mL CMA和5 μg/mL DAPI的抗熒光淬滅劑25～50 μL，蓋上蓋片(避光)。

熒光顯微鏡下觀察信號，450 nm激發下觀察CMA黃色熒光，紫外激發觀察DAPI藍色熒光。數碼顯微攝影系統照相。Photoshop軟件編輯處理圖像。

4 實驗結果

4.1 啤酒花染色體的CMA、DAPI熒光帶型

啤酒花雌株和雄株都分別具有20條染色體(2n=2x=20)，見圖1，其中二倍體雌性啤酒花的核型公式是：14 m+4 sm+2 Xm (圖1-A、圖2)；二倍體雄性啤酒花的核型公式是：14 m + 4 sm + Xm + Ym(圖1-B、圖3)。啤酒花每條染色體的著絲粒非常清晰，容易判別，且好的染色體制片還可以清楚觀察到每條染色體的兩條姐妹染色單體(圖1-A)，以及尺寸最小的雄性Y染色體(圖1-B，白色箭頭所指)。

分別通過CMA、DAPI兩種熒光染料對啤酒花雌雄株染色體進行熒光染色觀察，結果發現，CMA熒光和DAPI熒光都顯示出了啤酒花染色體的整體特征，染色體上沒有明顯的CMA帶型特征呈現。但我們仔細觀察并統計，發現CMA熒光染色能非常清楚地顯示出染色體上的隨體結構(圖2和3)。圖2-A、C所示在雄株染色體上有2個明顯的點狀隨體，且與染色體主體呈分離狀。圖2-B、A、D、C分別為啤酒花雄株同一個細胞分裂相，為DAPI熒光染色圖像，與CMA熒光染色圖像相比較，2個點狀隨體的熒光顯色不明顯，在觀察中容易被忽視。通過CMA、DAPI雙重熒光染色，觀察到啤酒花雌株染色體具有1個點狀隨體(如圖3-A、B中有尾箭頭所指部位)和1個不明顯的濃縮隨體(圖3-A、B中無尾箭頭所指部位)。

A 雌株，2n=2x=20； B 雄株，2n=2x=20，白色箭頭所指為Y染色體；標尺=20 μm

圖1 啤酒花雌雄株中期染色體(DAPI染色)

Figure 1 Metaphase chromosomes inH.lupulusby DAPI staining

4.2 啤酒花隨體染色體與性染色體

通過染色體的形態特征可知，染色體上主縊痕區域為著絲粒，次縊痕區為隨體，即核仁組織區(Nucleolar organizing region，NOR)。啤酒花染色體的形態圖結果顯示，雄株有2條染色體上分別具有2個明顯呈伸展狀態的隨體(如圖2-A、C中有尾箭頭所指部位)，雌株1條染色體上具有1個明顯呈伸展狀態的隨體(如圖3-A、B中有尾箭頭所指部位)，另1條染色體上具有1個不明顯的濃縮狀態隨體(如圖3-A、B中無尾箭頭所指部位)。二倍體雌性啤酒花有兩條X染色體，而雄性啤酒花只有一條X染色體，還有一條Y染色體。啤酒花雌雄株中染色體的形態結構差異不僅僅表現在一對性染色體的大小差別，同時在染色體NOR位點及伸展狀態上也有體現。雖然，不論是雌性還是雄性啤酒花都有兩個NORs，但是通過CMA染色，我們發現雌性啤酒花兩個NORs，只有一個位點有活性，呈伸展狀態，另一位點沉默，呈濃縮狀態。然而在雄性啤酒花中，兩個NORs都有活性，都呈伸展狀態。

綜合以上結果，我們分別繪制了啤酒花雌雄株染色體模型，如圖4和圖5所示。啤酒花雌雄株都含有10對染色體。雄株中第6對染色體具有一對呈伸展狀態、有活性的NORs，并含有一條X染色體和具有最小尺寸的Y染色體(圖4)。雌株中第5對染色體具有一個呈伸展狀態、有活性的NOR和一個呈濃縮狀態、沉默的NOR，并含有2條X染色體。

A、C為雄株染色體CMA染色，箭頭示意CMA顯帶的2個隨體；B、D為A與C圖中染色體DAPI染色。標尺=20 μm

圖2 啤酒花雄株CMA-DAPI顯帶中期染色體

Figure 2 Metaphase chromosomes in maleH.Lupulusby CMA-DAPI staining

A：雌株CMA/DAPI顯帶中期染色體，箭頭示意CMA顯帶的信號，其中有尾箭頭示意CMA顯帶的一個隨體，無尾箭頭示意另一同源染色體端部CMA信號；B：雌株CMA/DAPI顯帶早中期染色體，箭頭示意CMA顯帶的信號，其中有尾箭頭示意CMA顯帶的一個隨體，無尾箭頭示意另一同源染色體端部CMA信號；標尺=20 μm

圖3 啤酒花雌株CMA/DAPI顯帶染色體

Figure 3 Metaphase chromosomes in femaleH.Lupulusby CMA-DAPI staining

5 討論與結論

5.1 開設該實驗項目的意義

自然界中許多雌雄異株植物的雌株與雄株染色體組成具有顯著差異[6, 9]。該實驗課程將染色體制片與熒光顯微鏡技術相結合，可以在有限的課時安排中使學生獲得較好的實驗結果，使同學們直觀地觀察到啤酒花雌雄株染色體形態結構的差異特征。該實驗項目的開展不僅讓學生了解研究細胞遺傳學的方法，同時也讓學生對染色體熒光顯帶技術有一定的認識。通過該實驗課程的學習，學生應該能夠獨立完成所需材料的準備、試劑的配制、染色體制片方法和雙熒光染色技術，熟練掌握熒光顯微鏡的使用方法，拍攝到質量較好的染色體熒光照片，并能規范地展示實驗結果。

圖4 啤酒花雄株染色體模型

圖5 啤酒花雌株染色體模型

5.2 實驗安排的可行性

該實驗課課時安排為8學時。該實驗項目包括植物染色體制片技術、染色體雙熒光染色技術與熒光顯微鏡觀察等細胞生物學的基本技術手段，這些技術所涉及的相關實驗在部分高校已有開展，并且也具備一定的實驗條件。

5.3 本實驗的推廣與應用

1)實驗條件：要求具備植物培養室和熒光顯微鏡基本條件。2)教師的要求：實驗教師應熟練掌握扦插繁殖、雙熒光染色的基本操作方法，熟練掌握熒光顯微鏡的基本構造和使用方法。3)可在已開設植物染色體計數相關實驗的院校推廣。4)實驗材料：啤酒花，即使由于氣候、地域限制，溫室等植物種植條件等限制，還可以考慮換用校園常見植物葎草來代替。葎草(HumulusjaponicusSiebold&Zucc)，又叫拉拉藤，雌雄異株，分布廣泛。葎草與啤酒花同屬葎草屬植物，其染色體與啤酒花的染色體大小相似，數目相近，且同為雌雄異株植物。葎草雌株染色體16條，2n=16=14+XX；雄株染色體17條，2n=17=14+XY1Y2[20-21]。因此，本教學設計也可以因地制宜，采用分布廣泛的葎草來作為實驗材料。

本文通過設計生物學實驗教學中使用的雌雄異株植物材料，結合染色體的雙熒光染色, 獲得直觀、特異和清晰的圖像，使學生能夠更好地掌握雙熒光染色技術以及理解染色體的形態結構特點。該實驗課程設計簡單可行，適合在高校生物學實驗教學中推廣，是將科研成果應用于教學實踐的具體實例，為進一步加強科研成果促進教學改革提供了思路和借鑒，同時也為研究雌雄異株植物的苗期性別鑒定提供了技術參考。