基于點(diǎn)擊化學(xué)的蛋白酶修飾及其應(yīng)用

邵奕文， 王 強(qiáng)， 余圓圓， 王 平， 袁久剛， 范雪榮

(江南大學(xué) 生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 無(wú)錫 214122)

羊毛纖維因表面含有鱗片結(jié)構(gòu)，洗滌時(shí)容易產(chǎn)生氈縮現(xiàn)象。羊毛生物法防氈縮加工通過(guò)蛋白酶破壞羊毛纖維鱗片，減小定向摩擦效應(yīng)，達(dá)到羊毛防氈縮目的[1-3]，是一種綠色環(huán)保、節(jié)能高效的工藝。但常用蛋白酶分子量相對(duì)較小，容易擴(kuò)散進(jìn)入羊毛纖維，破壞纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)，在獲得較好防氈縮效果的同時(shí)往往纖維損傷較為嚴(yán)重[4-5]。研究表明，對(duì)蛋白酶進(jìn)行修飾，增大其分子量，可將酶的作用范圍限制在纖維表面，從而減小對(duì)纖維的損傷[6-8]。

酶的糖基化修飾常用方法有溴化氰法、還原烷基法和碳二亞胺偶合法等，但溴化氰有毒性，氧化還原程度難控制，修飾后酶的性能難以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)，因此，酶糖基化修飾的研究仍存在很大空間[9-12]。點(diǎn)擊化學(xué)是美國(guó)化學(xué)家Sharpless提出的一種簡(jiǎn)單反應(yīng)條件下連接小單元(碳-雜原子)快速合成大量化合物的新方法[13]，具有模塊化合成、高產(chǎn)率、反應(yīng)條件簡(jiǎn)單，起始原料和試劑容易獲得、無(wú)副產(chǎn)物或副產(chǎn)物易處理等特性，已被快速應(yīng)用于材料表面官能化、生物分子修飾、生物醫(yī)學(xué)等各種領(lǐng)域[14-15]。Cu (I) 催化的端基炔和疊氮化合物間的1,3-偶極環(huán)加成反應(yīng)(CuAAC)、巰基-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)、Diels-Alder反應(yīng)是最具代表性的點(diǎn)擊化學(xué)方法。

圖1 基于點(diǎn)擊化學(xué)的葡聚糖修飾蛋白酶反應(yīng)示意圖

本文以葡聚糖為修飾劑，采用疊氮-炔基點(diǎn)擊化學(xué)的方法對(duì)蛋白酶進(jìn)行化學(xué)修飾，從而增大蛋白酶分子量。通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳和圓二色譜表征修飾前后蛋白酶分子量和分子結(jié)構(gòu)的變化，并測(cè)定修飾前后蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)，最后將修飾前后的蛋白酶應(yīng)用于羊毛防氈縮整理進(jìn)行對(duì)比。

1 材料與方法

1.1 材料

蛋白酶(Savinase 16L，北京諾維信公司)；葡聚糖(Mw=20 000，BR級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；4-戊炔-1-醇[97%，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司]；1,1’-羰基二咪[97%，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司]；4-二甲氨基吡啶(99%，阿拉丁試劑有限公司)；其他化學(xué)試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Mini-PROTEAN電泳系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)；圓二色譜儀(MOS-450，法國(guó)Biologic公司)；熒光分光光度計(jì)(F-4600，日本Hitachi公司)；紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)[WFZUE-2100，尤尼柯(上海)儀器有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 蛋白酶預(yù)處理

將蛋白酶粗酶液用無(wú)水乙醇進(jìn)行二次沉淀，沉淀物溶于水后冷凍干燥，得到固體蛋白酶，此蛋白酶作為原蛋白酶。

1.2.2 疊氮化蛋白酶的合成

在原蛋白酶溶液(7 mg/mL，200 mL)中加入碳酸鉀溶液(2 mg/mL，100 mL)、硫酸銅溶液(1 mg/mL，25 mL)和重氮轉(zhuǎn)移劑[16](蛋白酶游離氨基的1.5倍當(dāng)量)，20℃下攪拌反應(yīng)12 h，結(jié)束反應(yīng)后用去離子水透析48 h，經(jīng)冷凍干燥得到疊氮化蛋白酶[17]。

1.2.3 炔基化葡聚糖的合成

無(wú)水二甲亞砜20 mL通氮?dú)夂蠹尤?.312 g 1,1-羰基二咪唑(CDI)，充分溶解，再逐滴滴加0.18 mL 4-戊炔-1-醇，20℃下通氮?dú)獯帕嚢? h，加入1 g無(wú)水葡聚糖和0.16 g 4-二甲氨基吡啶，繼續(xù)攪拌反應(yīng)48 h，反應(yīng)結(jié)束后用去離子水透析48 h，最后冷凍干燥[18]。

1.2.4 點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)

將200 mg抗壞血酸鈉和25 mg無(wú)水硫酸銅依次加入到疊氮化蛋白酶中(10 mg/mL，25 mL)，再加入過(guò)量炔基化葡聚糖，20℃下攪拌反應(yīng)12 h，反應(yīng)液用去離子水透析48 h，冷凍干燥得到葡聚糖修飾的蛋白酶(Savinase-Dextran)[15,19]。

1.2.5 SDS-PAGE凝膠電泳

將反應(yīng)前后的蛋白酶與上樣緩沖液混合均勻，沸水浴5～10 min，冷卻后加樣至4%～20%的梯度膠上，電壓150 V運(yùn)行至溴酚藍(lán)到達(dá)膠版底部。采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色法使樣品中的蛋白質(zhì)顯色，Schiff試劑染色法[20]使樣品中的葡聚糖顯色。

1.2.6 圓二色譜測(cè)試

采用圓二色譜儀對(duì)修飾前后蛋白酶的二級(jí)構(gòu)象進(jìn)行檢測(cè)，掃描波長(zhǎng)范圍190～250 nm，比色皿光程為1 mm，響應(yīng)時(shí)間為1 s，并通過(guò)CDPro軟件計(jì)算樣品的α-螺旋、β-折疊、轉(zhuǎn)角及無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的百分含量。

1.2.7 熒光光譜測(cè)試

采用F-4600熒光分光光度計(jì)對(duì)蛋白酶進(jìn)行測(cè)試，將樣品裝入1 cm四通石英比色皿中，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為200～500 nm，狹縫寬度為5 nm。

1.2.8 酶學(xué)性質(zhì)及動(dòng)力學(xué)性能測(cè)試

酶活測(cè)試方法為福林酚法[5]。測(cè)定修飾前后蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)變化，包括最適溫度、最適pH值、溫度穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性。采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法進(jìn)行蛋白酶修飾前后反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析。酶活測(cè)試均設(shè)置3組平行樣。

1.2.9 羊毛生物法防氈縮整理工藝

工藝流程：常溫浸漬(皂片2 g/L，浴比1∶25，10 min)→水洗→雙氧水預(yù)處理[21](30% H2O2，5 mL/L，焦磷酸鈉1.25 g/L，JFC 1 g/L，浴比1∶25，50℃，60 min)→酶處理[22](蛋白酶或修飾蛋白酶3 U/mL，浴比1∶25，pH 8.5，50℃，60 min)→水洗→后處理(充分水洗，80℃以上高溫失活15 min)→水洗、晾干[21]。

1.2.10 羊毛織物氈縮率測(cè)定

參照IWS TM No.31，氈縮率(%)=(1-S1/S0)×100%，式中S0、S1分別為洗滌前后羊毛織物的面積。

1.2.11 織物強(qiáng)力測(cè)試

參照GB/T 3923.1—1997，強(qiáng)力損失率(%)=(1-N1/N0)×100%，式中N0、N1分別為整理前后羊毛織物的斷裂強(qiáng)力。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白酶分子量

SDS-PAGE電泳能根據(jù)分子量大小將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，因此可以定性比較并判斷蛋白質(zhì)分子量大小。將一塊電泳膠上的兩組平行樣切開(kāi)，分別用考馬斯亮藍(lán)和Schiff試劑對(duì)蛋白質(zhì)和葡聚糖進(jìn)行染色。由圖2可以看出，原蛋白酶(泳道1)分子量范圍在25～35 ku之間，有雜蛋白存在。經(jīng)葡聚糖修飾后，在35 ku以上出現(xiàn)明顯譜帶(泳道3和6)，這表明修飾后蛋白酶分子量明顯增大。Schiff試劑是顯示醛基的特異性試劑，經(jīng)高碘酸(Periodic acid，過(guò)碘酸)氧化后新生成的二醛基與Schiff試劑(無(wú)色品紅)結(jié)合生成一種紫紅色物質(zhì)(醛染料產(chǎn)物)。泳道4底部顯色可能是由于酶液中雜蛋白含有糖類(lèi)物質(zhì)，經(jīng)Schiff染色反應(yīng)中用到的高碘酸氧化后生成醛基，與Schiff試劑發(fā)生顯色反應(yīng)。此外，我們從電泳圖中也可以看到，即使是純蛋白(Marker)，經(jīng)Schiff試劑作用也會(huì)有輕微著色；同樣，未修飾蛋白酶在泳道4出現(xiàn)了微弱的條帶。泳道5葡聚糖的顯色條帶主要集中在電泳膠頂端。與蛋白質(zhì)不同的是，葡聚糖無(wú)法和SDS結(jié)合帶上電荷，因此不能在電場(chǎng)作用下發(fā)生泳移，導(dǎo)致葡聚糖只能集中在頂端加樣孔附近，在20 ku處沒(méi)有相應(yīng)條帶。

2.2 蛋白酶結(jié)構(gòu)

2.2.1 圓二色譜分析

圓二色譜利用R和L兩種圓偏振光吸收程度的不同來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)借助圓二色譜，考察蛋白酶修飾前后二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[23-24]，并采用CDPro軟件計(jì)算得到蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)分布比例，結(jié)果如表1所示。

1、4：蛋白酶；2、5：葡聚糖；3、6：修飾蛋白酶

圖2 修飾前后蛋白酶的電泳圖Figure 2 SDS-PAGE results of enzymes

由表1可知，經(jīng)葡聚糖修飾后，蛋白酶的α-螺旋和轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量減少，β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量增加，修飾后蛋白酶結(jié)構(gòu)有所改變。這可能是由于葡聚糖為線(xiàn)型大分子，當(dāng)?shù)鞍酌负推暇厶嵌鄠€(gè)位點(diǎn)發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)后，蛋白酶肽鏈被拉伸，從而導(dǎo)致蛋白酶構(gòu)象發(fā)生變化。

2.2.2 熒光光譜分析

具有熒光性的物質(zhì)在激發(fā)波長(zhǎng)下會(huì)產(chǎn)生熒光發(fā)射光譜，而發(fā)射光譜受物質(zhì)結(jié)構(gòu)影響，因此熒光物質(zhì)發(fā)射光譜的變化能反映出結(jié)構(gòu)的變化。在蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸這三種芳香族氨基酸具有熒光特性。由圖3可知，蛋白酶最大發(fā)射波長(zhǎng)為344 nm，經(jīng)葡聚糖修飾后，其最大發(fā)射波長(zhǎng)未發(fā)生明顯變化，但熒光強(qiáng)度降低，這可能是由于修飾后蛋白酶分子結(jié)構(gòu)中可產(chǎn)生熒光的芳香族氨基酸被包埋所致。

圖3 修飾前后蛋白酶熒光光譜圖

2.3 酶學(xué)性質(zhì)

溫度和pH值會(huì)對(duì)酶的活性造成影響，生物酶通常有最適溫度和最適pH值，且在不同溫度和pH值條件下的穩(wěn)定性也不同。本文測(cè)定修飾前后蛋白酶的最適溫度和最適pH值，并在不同溫度條件下保存1 h后測(cè)定其溫度穩(wěn)定性，在不同pH值條件下保存24 h后測(cè)定其pH值穩(wěn)定性，結(jié)果如圖4所示。

由圖4-a可知，蛋白酶最適溫度約為70℃，在60℃到80℃均保持較高的酶活，而葡聚糖修飾蛋白酶最適溫度為60℃，但在70℃也保持了較高活性。由圖4-b可知，隨著儲(chǔ)存溫度的升高，蛋白酶殘余酶活均有所降低，且溫度越高，對(duì)酶活影響越大。經(jīng)50℃處理1 h后仍能保留約80%的相對(duì)酶活。葡聚糖修飾蛋白酶在60℃以下與蛋白酶基本呈現(xiàn)相同變化趨勢(shì)，但在70℃已基本失活。Savinase是一種枯草桿菌堿性蛋白酶，在堿性反應(yīng)環(huán)境下具有較高酶活。由圖4-c可知，蛋白酶酶活在pH值11時(shí)達(dá)到最大，修飾后蛋白酶的最適pH為11，且在pH 10～12范圍內(nèi)仍能保持較高活性。由圖4-d可知，在酸性條件下保存，蛋白酶酶活損失較大，而在堿性條件下，蛋白酶穩(wěn)定性較高；葡聚糖修飾蛋白酶的pH值穩(wěn)定范圍略大于蛋白酶。

圖4 蛋白酶修飾前后的酶學(xué)性質(zhì)

2.4 酶促動(dòng)力學(xué)分析

酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)用于考察酶催化反應(yīng)速率及其影響因素，有助于進(jìn)一步了解酶的特性。米氏常數(shù)是研究酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的重要參數(shù)，根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖(圖5)，線(xiàn)性擬合Lineweaver-Burk方程可知，蛋白酶：y=157.19x+35.35(R2=0.996)，葡聚糖修飾蛋白酶：y=66.70x+11.23(R2=0.968)。根據(jù)米氏方程計(jì)算可知，蛋白酶修飾后米氏常數(shù)Km從4.45 g/L提高到5.94 g/L，說(shuō)明修飾后蛋白酶與底物之間的親和力變小。這可能是由于修飾后蛋白酶的構(gòu)象受到葡聚糖限制，當(dāng)酶與底物結(jié)合時(shí)，蛋白酶缺乏必要的分子鏈柔韌性，因此親和力下降；此外，葡聚糖修飾后，空間位阻增大，也可能導(dǎo)致蛋白酶與底物的親和力下降。

2.5 修飾酶在羊毛防氈縮整理的應(yīng)用

羊毛織物分別用蛋白酶和修飾蛋白酶進(jìn)行防氈縮整理，并測(cè)定其氈縮率和強(qiáng)力，結(jié)果如表2所示。

圖5 原蛋白酶和修飾后蛋白酶的Linewever-Burk圖

酶氈縮率(%)斷裂強(qiáng)力(N)強(qiáng)力損失率(%)斷裂伸長(zhǎng)(%)蛋白酶2.99471.018.1670.61修飾蛋白酶5.31510.811.2471.80

由表2可知，葡聚糖修飾蛋白酶處理的羊毛織物氈縮率為5.31%，雖高于蛋白酶處理，但防氈縮效果仍達(dá)到國(guó)際羊毛局“機(jī)可洗”要求。更重要的是，修飾蛋白酶處理織物在保持較好防氈縮效果的同時(shí)，織物強(qiáng)力損失明顯降低。這表明葡聚糖修飾蛋白酶由于分子量增大，導(dǎo)致酶進(jìn)入羊毛纖維內(nèi)部的空間阻力增大，從而將酶水解作用限制在羊毛纖維表面，既保障了羊毛織物防氈縮整理的效果，又減小了織物強(qiáng)力的損失，達(dá)到了預(yù)定的蛋白酶修飾目的。

3 結(jié)論

本文采用新穎的點(diǎn)擊化學(xué)進(jìn)行蛋白酶的化學(xué)修飾，即通過(guò)端基炔和疊氮基團(tuán)的特定反應(yīng)，成功合成葡聚糖修飾蛋白酶。研究結(jié)果表明，與未修飾蛋白酶相比，修飾后蛋白酶分子量明顯增大，整體構(gòu)象有所改變，雖酶活略有降低，但溫度和pH值對(duì)酶活的影響與蛋白酶相似。在羊毛防氈縮整理中，葡聚糖修飾蛋白酶處理的羊毛織物在防氈縮效果達(dá)到國(guó)際羊毛局“機(jī)可洗”標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，具有更低的強(qiáng)力損失，顯示其比未修飾蛋白酶更適于羊毛防氈縮整理加工。