不同品種啤酒中黃腐酚含量差異性成因的研究

趙惠新， 周 茜， 曾衛(wèi)軍， 盧 函， 趙和平

(1. 新疆師范大學 新疆特殊環(huán)境物種保護與調(diào)控生物學實驗室 干旱區(qū)植物逆境生物學實驗室，烏魯木齊 830054; 2. 北京師范大學 抗性基因資源與分子發(fā)育北京市重點實驗室, 北京 100875; 3. 喀什大學 生命與地理科學學院， 喀什 844006)

黃腐酚(Xanthohumol，簡稱Xn)由酒花蛇麻腺分泌產(chǎn)生，自1913 年在酒花中被發(fā)現(xiàn)以來，其分子結構及作用就備受關注。Xn是一種結構簡單的含異戊二烯基的查耳酮[1]。諸多研究表明，Xn具有防癌抗癌作用[2-7]，如能夠有效抑制小鼠乳腺癌細胞生長，并通過調(diào)節(jié)輔助性T細胞平衡促進機體抗腫瘤免疫[8]。另外Xn還有預防和治療糖尿病[9]、抗氧化[10]、抑制骨質(zhì)增生、抗誘變[11]、抗菌[12]、抑制甘油二酯?；D移酶活性及預防動脈硬化等生物活性[13]。目前，人們從日常飲料、食品中攝取Xn的主要途徑是飲用啤酒，這使得被譽為液體面包的啤酒，遠遠超過了解渴飲料的價值，具有良好的保健功效。然而，在啤酒釀造過程中Xn易產(chǎn)生光異構化，形成異黃腐酚 (Isoxanthohumol，簡稱IX)，IX保健活性大大降低，約為Xn的功效的十分之一[14]。對不同色度的啤酒中Xn含量的分析表明，黑啤酒及深色啤酒中的含量明顯高于普通(淺色)啤酒中的[15]。如：燕京、雪花等淺色啤酒黃腐酚含量大約為2.2～3.5 μg/L，而德國黑啤在12 μg/L以上[16]。有研究者認為，在深色麥芽中有阻礙Xn異構化的物質(zhì)，這些物質(zhì)可溶解于水，且分子量小于3000[14]。但目前并沒有真正分離到這種具有抑制Xn光異構化為IX的活性物質(zhì)。

前期研究在探討Xn穩(wěn)定性因素時發(fā)現(xiàn)，光照時間、強度、波長等對異構化影響很大，而深色啤酒較淺色啤酒的透光性差別也很大，因而我們提出是否是因為深色啤酒透光性低于淺色啤酒，因而使深色啤酒中的Xn異構化較慢這一問題，并試圖提供實驗證據(jù)，期望為啤酒釀造中提高Xn含量提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

啤酒花顆粒，采自奇臺農(nóng)場瓶酒花生產(chǎn)基地的札一香花，委托新疆瓶酒花股份有限公司烘焙加工顆粒，錫箔袋分裝、避光常溫保存。淺色啤酒選擇烏蘇啤酒、青島啤酒、北京燕京啤酒，黑啤酒選擇了由德國釀造的海德堡(Heidelberg)黑啤、埃爾巴赫(Irlbacher)黑啤及本地產(chǎn)的新疆黑啤。黑墨水選擇英雄牌黑墨水。甲醇、乙醇均為分析純，去離子水為本實驗室制備。

1.2 儀器與設備

FDU-1200型冷凍干燥器，東京理化器械株式會社；KQ-250B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UV-2800型紫外分光光度計，尤尼柯儀器有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱HZ-2029，烏魯木齊祥生儀器有限公司；40 W白色光源LED燈，歐普商城；HEAL FORCE EASY 15 超純水儀，新疆致遠科創(chuàng)生物科技有限公司。

1.3 Xn樣品的提取

有機溶劑浸提：稱取150 g酒花樣品，加入500 mL的 45%乙醇，室溫、300 W的條件下超聲浸提15 min，用0.45 μm濾膜過濾，收集濾液，利用旋轉蒸發(fā)器將濾液低溫濃縮(浸提及濃縮過程盡量避光)。

樣品去色素純化：向濃縮液中加入60 g 硅藻土，混勻后抽濾。先用300 mL 洗脫液 I(V甲醇∶V水=1∶4)洗脫，棄去洗脫液。再用600 mL洗脫液 Ⅱ(V甲醇∶V水=2∶1)洗脫，收集洗脫液。旋轉蒸發(fā)后，并用 0.2 μm的濾膜超濾，冷凍干燥避光保存。使用時取提取的Xn凍干粉5 mg，用 1 mL的 45% 乙醇溶解后，用去離子水稀釋并定容至10 mL，為待測溶液。若需其他體積的溶液，按此劑量比例關系進行配制。

1.4 樣品純及含量檢測

測定該溶液在波長 200～700 nm 范圍的光譜，并與 0.25 mg/mL 的標準品的掃描光譜進行比較，分析樣品中Xn的純度和含量。

1.5 不同品種啤酒或黑墨水覆蓋遮光對Xn樣品光異構化影響實驗

首先通過分光光度法測定所選擇的不同啤酒及稀釋50倍的黑墨水的A430，并按照“色度(EBC)= 10×1.27×A430-1.2”計算各品種啤酒及稀釋黑墨水的色度[17]。取25個100 mL 側壁與底部用錫箔紙包裹的燒杯，各加入 30 mL 的Xn樣品，在樣品上表面覆蓋一層塑料保險膜，膜盡可能鋪平，且周邊留出約5～6 cm，緊貼于燒杯壁。在膜上小心注入不同類品種的啤酒及黑墨水， 7個樣品的膜上分別覆蓋1 cm深的3種淺色啤酒、3種深色啤酒以及稀釋黑墨水，7個覆蓋的是2 cm深，另外7個覆蓋的是3 cm深。3個分別加1、2和3 cm深的去離子水做光照對照。置于25℃培養(yǎng)箱中。另外 1 個樣品完全用錫箔紙包裹3層，作為避光對照。打開40 W白色光源 LED 光源處理10 h后，測定樣品OD370(如圖1)。

a: Xn樣品；b:Xn樣品上覆蓋完整的塑料膜；c: Xn覆蓋的膜上加注定量的啤酒或稀釋黑墨水；d: 將整個燒杯的側面和下面用錫箔紙包裹；e: 用40 W的LED白光照射d處理后的樣品；f: 光照處理時在密閉、不透光、25℃的恒溫箱中進行

圖1 不同啤酒及墨水覆蓋遮光的實驗示意圖

Figure 1 Experimental schematic of covering light with different brewers and ink

1.6 混合不同品種啤酒對Xn樣品光照穩(wěn)定性影響

取8個100 mL側壁與底部用錫箔紙包裹的燒杯，各加入兩倍濃度的15 mL的Xn樣品，6個中再分別加入15 mL青島啤酒、烏蘇啤酒、燕京啤酒、海德堡黑啤酒、埃爾巴赫黑啤、新疆黑啤，置于恒溫箱進行40 W的LED白光光照。另外2個燒杯中也各加入15 mL 去離子水，一個做避光對照，一個做光照對照。10 h后，分別以每個燒杯中終濃度相同的啤酒溶液為空白參比，測定各處理樣品OD370。

1.7 黑墨水覆蓋遮光條件下，混合不同品種啤酒對Xn樣品光異構化的影響

取7個100 mL側壁與底部用錫箔紙包裹的燒杯，各加入兩倍濃度的Xn樣品15 mL，再分別加2 mL的去離子水及各種啤酒，最后加去離子水13 mL。頁面均覆蓋3 cm厚度的稀釋黑墨水，置于恒溫箱進行40 W的LED白光照。10 h后，分別以每個燒杯中終濃度相同的啤酒溶液為參比，比較各處理樣品OD370。所有實驗均重復4次。

2 結果與分析

2.1 樣品純度及含量檢測

如圖2和3所示，待試樣品與標準Xn樣品相比，二者紫外吸收光譜均在OD370有特異吸收峰，前者稍低于或者，即說明濃度稍低于標準樣品 0.25 mg/mL。而在紫外區(qū)波形差異不大，可見光區(qū)待測樣品有光吸收峰，但不影響Xn的特征峰，能夠以OD370的值檢測樣品Xn含量。

圖2 標準Xn樣品紫外及可見光光譜圖Figure 2 UV and visible light spectrograms of standard Xn samples

圖3 待測Xn樣品紫外及可見光光譜圖Figure 3 UV and visible spectrograms of Xn samples to be measured

2.2 不同品種啤酒及稀釋黑墨水的色度

以去離子水作為參比，得到的稀釋的黑墨水及不同品種啤酒的色度。結果(圖4)顯示，3種淺色啤酒的色度均在7～8 EBC之間，3種黑啤及稀釋黑墨水的色度均在EBC 40～50間。色度可以間接指示溶液的透光度，一般來講，色度越大透光度約低。黑啤的色度顯著大于淺色啤酒，因而相同厚度的前者遮光效果顯著強于后者。

圖4 不同品種啤酒及稀釋黑墨水色度分析Figure 4 The chromaticity of different breeds of beer and diluted black ink

2.3 添加不同啤酒對Xn樣品光照穩(wěn)定性影響

不同啤酒對Xn樣品光照穩(wěn)定性測定結果如圖 5所示。同濃度的黃腐酚樣品，經(jīng)40 W光照處理10 h后，OD370下降至對照的15%左右，但添加等體積的幾種淺色啤酒的Xn樣品，光照處理后OD370為對照的35%左右，而添加幾種深色啤酒的Xn樣品，光照處理后OD370為對照的55%左右。表明黑啤較淺色啤酒能更有效抑制Xn進行光異構化。添加色度相近的啤酒對Xn樣品光異構化的抑制作用類似，色度大的抑制作用高，色度小的抑制作用低。但啤酒能夠抑制Xn進行光異構化，而且黑色啤酒抑制效果顯著優(yōu)于淺色啤酒，是否是因為啤酒中含有小分子抑制劑，還需要進一步實驗依據(jù)。

圖5 添加不同色度啤酒對Xn樣品光照穩(wěn)定性影響Figure 5 Effect of different chromas of beer on the light stability of Xn samples

2.4 覆蓋不同厚度的不同品種啤酒遮光對Xn樣品光照穩(wěn)定性影響

為了分析啤酒能夠抑制Xn進行光異構化的原因，進一步用啤酒覆蓋Xn樣品進行遮光，分析不同品種啤酒及不同遮光厚度對Xn樣品光異構化的影響。結果(圖6)顯示，各種啤酒覆蓋遮光，均能顯著抑制Xn樣品的OD370下降，且每種品種啤酒遮光，覆蓋厚度越厚，抑制Xn光異構作用越顯著；不同品種黑啤的相同覆蓋厚度，對Xn樣品的光異構化的影響差異不顯著，不同品種淺色啤的相同覆蓋厚度，對Xn樣品的光異構化的影響差異也不顯著；相同厚度的黑啤抑制Xn樣品光異構化的作用顯著強于淺色啤酒。以上結果與添加不同啤酒對Xn樣品光吸收值影響的實驗結果相一致。

圖6 不同品種啤酒覆蓋遮光不同厚度對Xn樣品光照穩(wěn)定性影響Figure 6 Influence of different thickness of different breeds of beer covering light on the light stability of Xn samples

圖 7 黑墨水覆蓋遮光對Xn樣品光照穩(wěn)定性影響Figure 7 Effect of dark ink covering light on the illumination stability of Xn samples

2.5 稀釋黑墨水覆蓋遮光對Xn樣品光照穩(wěn)定性的影響

為了進一步確定遮光是不是不同色度啤酒抑制Xn光異構化的主要原因，進一步用稀釋黑墨水替換啤酒進行Xn樣品的覆蓋遮光，結果表明，覆蓋1、2和3 cm的黑墨水，光照處理后，樣品OD370分別下降至避光組的50%、61%、70%左右，即黑墨水蓋厚度越大，抑制光異構化效果越強(圖7)，且與相似色度、覆蓋相同厚度的黑啤抑制效果相似，其中用黑墨水及幾種深色啤酒覆蓋1 cm遮光，光照處理后，OD370均下降至避光組的50%左右(圖8)。

圖8 覆蓋1 cm厚度的不同色度啤酒及稀釋黑墨水對Xn樣品光照穩(wěn)定性影響Figure 8 Influence of different chromaticity and diluted black ink on the illumination stability of Xn samples covering the thickness of 1 cm

2.6 黑墨水覆蓋遮光條件下，添加不同品種啤酒對Xn樣品光異構化的影響

在Xn樣品中添加少量不同品種啤酒，當用相同濃度、3 cm厚度的黑墨水覆蓋，光照處理后，各Xn樣品的OD370組間無顯著性差異，均下降至避光組的70%左右，且與不添加啤酒的樣品間也沒有差異(圖9)。表明當不同啤酒自身的遮光作用不占主要遮光作用時，啤酒本身并不抑制Xn樣品的光異構化，間接證明黑啤中并不含有Xn異構化的抑制劑的論斷。從而說明，不同啤酒品種的啤酒中Xn含量不同，是由于色度不同而透光度不同造成的。即黑色啤酒中含Xn高于淺色啤酒的主要原因在于透光性不同的物理作用，而不是含有小分子抑制劑的化學作用。

圖9 遮光對添加不同品種啤酒后的Xn光異構化的影響Figure 9 Effect of light shading on Xn photoisomerization after adding different breeds of beer

3 討論

啤酒的色度常用EBC 單位表示, 淡色啤酒大多為5～14 EBC , 深色啤酒大多數(shù)為15～40 EBC，黑色啤酒色度大于40 EBC[15]。啤酒色度的差異主要是由于麥芽焙焦及麥芽汁制備工藝中生成焦糖或類黑精和多酚物質(zhì)的氧化、聚合所造成[18]。不同啤酒中的Xn含量差別很大，往往是深色及黑色啤酒中Xn含量顯著高于淺色啤酒的，被認為其成因是深色及黑色啤酒中存在小分子量的抑制物質(zhì)，但沒有可靠的證據(jù)。

啤酒中的Xn來源于酒花。在不同啤酒釀造過程中，添加的酒花，并不因為是淺色啤酒還是黑色啤酒而改變酒花的質(zhì)量和含量，因而Xn的原料并無質(zhì)和量的差異。因此不同啤酒中Xn含量不同是釀造過程及儲存過程造成的。通過覆蓋不同品種啤酒的實驗結果分析，間接地說明了黑色啤酒中Xn含量顯著高于淺色啤酒的，是因為高色度的黑啤較低色度的淺色啤酒對光在溶液中傳播阻礙作用更大，使得深層的Xn受到照射的光強度更低，光異構化則低，表現(xiàn)出黑啤中Xn含量高于淺色啤酒。另外，向Xn樣品中添加不同品種啤酒，并用相同覆蓋厚度的黑墨水遮光處理，不同處理間的Xn光異構化程度并無顯著性差異，進一步說明不同啤酒中的所含物質(zhì)本身對Xn的光異構化并無影響。本實驗中的光照采用了白光，不同遮光措施遮光后，對Xn光異構化的影響不同，但是否Xn的光異構化受照射波長的影響，需要進一步探討。

本文為啤酒發(fā)酵及啤酒儲存的光照條件選擇提供了依據(jù)。發(fā)酵過程可以盡可能用較暗的光照條件，啤酒儲存可以避光或用透光度低的材料的容器儲存，這些措施可有效減緩啤酒中Xn的異構化速度，提高啤酒的保健功效。