工廠化淡水養殖凡納濱對蝦甲殼潰瘍癥病因與防治研究

樊慧敏， 馬倩倩， 商澤昊， 張子涵， 董昭然， 唐慶權， 許曉牧，王黎明， 朱若林， 鮑傳和,2,3， 彭開松,2,3， 萬 全

(1. 安徽農業大學 動物科技學院 水生健康與公共衛生實驗室， 合肥 230036； 2. 安徽農業大學 新農村研究院江淮分水嶺(定遠)綜合試驗站， 定遠 233200； 3. 安徽省現代農業產業技術體系(水產)健康養殖研究室， 合肥 230036； 4. 安徽海輝水產養殖有限公司， 定遠 233200)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)，俗稱南美白對蝦，屬節肢動物門(Arthopoda)、甲殼綱(Crustacean)、十足目(Decapoda)、游泳亞目(Natantia)、對蝦科(Penacidae)、濱對蝦屬(Litopenaeus)[1]，是世界3大養殖對蝦之一，也是我國重要養殖蝦類[2]。凡納濱對蝦為廣溫、廣鹽性熱帶蝦類，是近年供給側結構調整中重要的淡水養殖品種。因適應高密度養殖，該蝦的工廠化海水或半咸水養殖發展迅速且成熟，而工廠化淡水養殖尚屬起步階段。雖然該蝦的淡水養殖可能會降低弧菌病風險，卻會增加氨氮和亞硝酸鹽氮中毒風險[3]；氮代謝廢物中毒后，蝦更容易感染各種條件致病菌，如舒氏氣單胞菌可引起淡水養殖凡納濱對蝦紅體病[4]。氣單胞菌科(Aeromonadaceae)、氣單胞菌屬(Aeromonas)的成員廣泛分布于淡水、污水、淤泥、土壤等自然環境。氣單胞菌屬成員分為致病株和非致病株，前者可感染幾乎所有門類的動物，是淡水水生動物的重要病原菌[5]，也是新發重要人畜共患病病原[6]，是國家食品安全檢疫的重點對象。氣單胞菌可引起淡水蝦的疾病[7-8]，但還未見氣單胞菌可引起工廠化淡水養殖凡納濱對蝦甲殼潰瘍癥的報道。筆者對工廠化淡水養殖凡納濱對蝦甲殼潰瘍癥病例進行了病因和防治研究，旨在為該病的診斷和防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

培養基、藥敏紙片、氧化酶試紙和細菌微量生化鑒定管均購自杭州微生物試劑有限公司；細菌基因組DNA抽提試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；TaqDNA聚合酶購自北京康為世紀生物科技有限公司；DNA膠回收試劑盒購自愛思進生物技術(杭州)有限公司；連接試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司。蛋氨酸碘(有效碘含量4.5%～6%)購自惠州市三寶生物化學科技有限公司；聚維酮碘1(有效碘含量0.2%)購自合肥中龍神力動物藥業有限公司；聚維酮碘2(有效碘含量1%)購自武漢中博水產生物技術有限公司；菌毒克(有效碘含量1.5%)、應激康、大補100等購自上海綠望生物科技有限公司。

1.2 臨床診斷分析

對本病例發病前后的養殖管理、水質情況和病毒及寄生蟲進行了臨床分析。

1.3 細菌的分離純化和鑒定

用于細菌分離的患蝦和發病池水于2016年11月取自安徽省滁州市定遠縣某工廠化養殖場?；嘉r經表面消毒和漂洗后，無菌制備肝胰腺懸濁液，用TCBS瓊脂分離純化細菌。同樣培養基分離純化發病池水中細菌。純化細菌28℃培養16 h后，觀察菌落形態，按操作手冊進行革蘭氏染色、氧化酶試驗和發酵試驗，并用細菌微量生化鑒定管進行生理生化試驗。參照朱若林等[9]方法進行16S rRNA基因擴增、系統進化分析和毒力基因檢測。

1.4 浸泡攻毒試驗

體長(8.5±1.1)cm的淡水養殖凡納濱對蝦，養殖池水過濾后加入水族箱(水體積100 L)，經過硫酸氫鉀復合鹽消毒后充分曝氣24 h，維持水溫28℃，進行本動物浸泡攻毒試驗。每株菌的攻毒試驗分6個試驗劑量組：0 (空白對照)、105、106、107、108和109cfu/mL，50尾蝦/劑量組。試驗期間按蝦攝食狀況投餌，不排污。觀察14 d，取瀕死蝦或剛死蝦，重新進行細菌分離鑒定。

1.5 內服抗菌藥物和外用消毒劑的篩選

參考國家行業(商業)檢驗標準(SN/T 3229—2012)[10]，采用稀釋-中和法進行消毒劑的藥敏試驗。參考歐盟標準[11]，采用K-B紙片擴散法及MIC肉湯稀釋法進行內服抗菌藥物的藥敏試驗。

1.6 防治研究

根據以上病因分析和藥物篩選結果，采用綜合防治措施，對本病進行了防治試驗。

2 結果與分析

2.1 臨床診斷及病毒和寄生蟲病因的排除

根據養殖記錄和試驗檢測，對水質、管理、病毒和寄生蟲等病因進行了如下分析。水源采自地下水，經檢測常規離子和重金屬含量符合《漁業水質標準(GB11607)》和《無公害食品淡水養殖用水水質標準(NY 5051—2001)》，出水水溫30℃。經過曝氣和調溫后進入養殖池。水溫和溶解氧24 h實時監控，水溫維持在25℃～28℃之間，日水溫波動在1℃以內，溶解氧維持在6～8 mg/L。每天排污2～3次。水體氨氮和亞硝酸鹽含量根據投餌狀況1～3 d測定1次。根據蝦齡和規格投喂蝦奶粉(澳華)及對蝦料(0#、1#、2#)。間隔性潑灑芽孢桿菌、EM菌、乳酸菌和綠藻源等肥水產品以維持水體透明度20～30 cm。購進的P8期苗(鹽度15)經過3周的淡化和標粗后，分池進行養殖。養成期間，根據水源水和定期測定的養殖池水的鈉鉀鈣鎂濃度補充鉀鎂鈣鹽，鹽度不超過2。根據水質狀況2～3周分池1次。養殖中除清洗水泥池外，未使用消毒劑。

患蝦體長6～8 cm。病初患蝦觸須和附肢發紅，然后逐漸出現空胃空腸，肝胰腺腫脹、微紅。2～3 d后，患蝦甲殼現黑色點狀病灶，中心潰爛；頭胸甲容易剝離，肝胰腺發紅發黃、糜爛。發病前3～5 d持續陰天，發生藻類大量死亡。發病時池水氨氮濃度均高于1.1 mg/L，最高達2.0 mg/L；亞硝酸氮濃度均高于0.15 mg/L，最高達0.25 mg/L。第一棟大棚的20個養殖池，1周內陸續發病，發病池數占總池數的80%。單池發病率10%～70%不等，死亡率5%～60%不等。本次放養苗種來源于卜蜂水產(東方)有限公司。經檢測，苗種和患蝦的白斑綜合病毒、傳染性皮下及造血組織壞死病毒、桃拉綜合征病毒、腸孢子蟲和EMS副溶血弧菌等均為陰性。正常蝦和患蝦的鰓部、體表和內臟的寄生蟲檢查中未發現可疑蟲體。綜合上述初步診斷結果，本病病因可初步排除病毒和寄生蟲。氨氮和亞硝酸氮超標可能是重要誘因，細菌性病原有待后續研究確定。

2.2 細菌的分離純化和鑒定

用TCBS平板分別從患蝦肝胰腺和池水分離純化得兩株優勢菌，并命名為F-L株和F-W株。分離株28℃過夜培養，在TCBS表面形成表面光滑、邊緣整齊、凸起的黃色圓形菌落。F-L株和F-W株經鑒定為革蘭氏陰性菌，且氧化酶、賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、蔗糖、甘露醇及水楊苷均為陽性；6% NaCl胨水均為陰性。此外，F-L株的葡萄糖產氣為發酵型，枸櫞酸鹽為陽性；而F-W株的葡萄糖產氣為氧化型，枸櫞酸鹽為陰性。

根據細菌編碼鑒定手冊，F-L株和F-W株分別疑似凡隆氣單胞菌群和嗜水氣單胞菌群成員。F-L株和F-W株的16S rRNA基因測序BLAST比對顯示，分別與凡隆氣單胞菌和點狀氣單胞菌的相似性最高，均為99%，系統發育樹如圖1。因此，綜合形態、生理生化和16S rRNA基因序列，可確定F-L株為凡隆氣單胞菌，F-W株為點狀氣單胞菌(現已歸屬于嗜水氣單胞菌)。

由圖2可知，可從凡隆氣單胞菌F-L株中檢測到6種毒力基因的單一條帶；而熱不穩定性腸毒素Alt和彈性蛋白酶ahyB可擴增到多個條帶，其中含與預計大小相符的條帶(分別為442 bp和513 bp)；未檢測到熱穩定性腸毒素Ast和溶血素hlyA。從點狀氣單胞菌F-W株中檢測到6種毒力基因的單一條帶，未檢測到熱穩定性腸毒素Ast、細胞毒性腸毒素Act、核酶Exu和絲氨酸蛋白酶Ser。從基因水平可知，分離株均為致病性氣單胞菌。

圖1基于16S rRNA序列構建的 F-L株和F-W株系統進化樹

M：DNA分子質量標準DL2000；1：氣溶素；2：細胞毒性腸毒素；3：熱不穩定性腸毒素；4：熱穩定性腸毒素；5：絲氨酸蛋白酶；6：酯酶；7：鞭毛；8：核酶；9：彈性蛋白酶；10：溶血素

圖2分離株毒力基因的PCR擴增電泳圖

Figure 2 PCR amplification of virulence genes of F-L and F-W

2.3 浸泡攻毒回歸試驗

凡納濱對蝦在攻毒后5～10 d相繼發病，2株菌均能不同程度地引起蝦的死亡，并有個別死亡蝦有甲殼潰瘍癥狀，使用簡化寇氏法計算LD50。F-L株的各攻毒組隨攻毒濃度升高(106、107、108和109cfu/mL)發病率依次為14%、44%、64%及96%；死亡率依次為6%、32%、54%及90%，其LD50為107.68cfu/mL。F-W株的各攻毒組隨攻毒濃度升高(106、107、108和109cfu/mL)發病率依次為18%、42%、60%和86%；死亡率依次為10%、32%、48%和80%，其LD50為107.8cfu/mL。人工感染發病蝦肝胰腺分離菌的經檢測為攻毒所用菌株。

2.4 外用消毒劑和內服抗菌藥物的藥敏試驗

菌毒克對兩株分離菌的殺滅效果最好，MIC均為1.88 μL/mL，其次為蛋氨酸碘，對兩株菌的MIC均為3.75 μL/mL。防治試驗也顯示菌毒克對甲殼潰瘍蝦的預防和治療效果最好。此外，使用聚維酮碘1+菌毒克(1∶1)和聚維酮碘2+菌毒克(1∶1)對兩株菌的MIC均為3.75 μL/mL；而單用聚維酮碘1對兩株菌的MIC均為833.33 μL/mL，單用聚維酮碘2對兩株菌的MIC均為30 μL/mL。

紙片法測定了2株菌對19種抗菌藥物的敏感性(表1)。兩株分離菌對甲氧芐啶、諾氟沙星、新霉素、恩諾沙星、氧氟沙星、氯霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素和交沙霉素均敏感；F-L株對氟苯尼考、紅霉素敏感，對頭孢噻吩、環丙沙星和強力霉素中敏；F-W株對環丙沙星敏感，對強力霉素和紅霉素中敏。進一步采用MIC法測定了2株菌對14種抗菌藥物的敏感性，結果如下：氨芐西林鈉、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、鹽酸土霉素及交沙霉素對F-L株和F-W株的MIC均大于或等于256 μL/mL。硫氰酸紅霉素和甲砜霉素對F-L株和F-W株的MIC均為128 μL/mL。強力霉素和氟苯尼考對F-L株和F-W株的MIC分別為16和64 μL/mL。硫酸新霉素對F-L株和F-W株的MIC分別為8和128 μL/mL；恩諾沙星對F-L株和F-W株的MIC分別為16和32 μL/mL；鹽酸環丙沙星對F-L株和F-W株的MIC分別為4和16 μL/mL。

綜合兩種方法測定所得的內服抗菌藥物敏感性試驗結果，可使用的國標漁藥只有恩諾沙星；后續防治試驗也進一步證實了內服恩諾沙星對本病有效。

2.5 防治試驗效果

根據以上病因分析和試驗，采用外用和內服相結合的方法，進行了防治試驗。

外用方案以全池潑灑為主。第1天使用菌毒克0.5 g/m3；第2天上午使用硫代硫酸鈉中和碘，下午使用“穩水110”和“亞硝克”吸附氨氮和亞硝酸氮，晚上將吸附氨氮和亞硝酸氮后的沉積物排出；第3天開始依次使用乳酸菌、光合細菌、芽孢桿菌、酵母菌調水，同時每天使用小球藻培藻直到無新增病例。每天3次排出死蝦。

內服方案采用伴料內服。恩諾沙星、應激康和三黃散拌料內服3 d；第4天開始使用乳酸菌、應激康、大補100和保肝寧拌料內服7 d。待蝦康復后，繼續使用乳酸菌、大補100和應激康保護蝦的腸肝。

經過上述綜合處理后，除少部分(約占30%)發病嚴重的池外，大部分池中的患蝦均相繼康復。

3 討論

凡納濱對蝦甲殼潰瘍癥的病原可能為弧菌、假單胞菌、革蘭氏陽性菌及真菌等[12]。雖然氣單胞菌可普遍引起魚類皮膚潰瘍病[13-14]，但未見其引起蝦甲殼潰瘍的報道。本研究中的凡隆氣單胞菌F-L株和點狀氣單胞菌(現劃歸為嗜水氣單胞菌)F-W株不僅攜帶多種典型的氣單胞菌毒力基因，且人工浸泡感染均能引起淡水養殖凡納濱對蝦的甲殼潰瘍癥。凡隆氣單胞菌和嗜水氣單胞菌都可以分泌幾丁質酶[15-16]，該酶能分解蝦甲殼中的幾丁質，進而引起甲殼潰瘍。分離菌敏感的外用消毒劑和內服抗菌藥物能在一定程度上控制該病發展，從防治角度進一步驗證分離菌是本病病原。綜上可知，凡隆氣單胞菌F-L株和點狀氣單胞菌(現在歸屬于嗜水氣單胞菌菌群)F-W株是引起本病例中甲殼潰瘍的病原。

表1 內服抗菌藥物的藥敏試驗

注：藥敏紙片直徑約6 mm、厚度約1 mm，平板瓊脂餅厚度平均約5 mm

水體中的高氨氮和高亞硝酸氮是誘發水產動物氣單胞菌的重要因素[3]。本研究也發現只有維持良好水質，特別是菌藻平衡、降低水體中氨氮和亞硝酸氮達到正常水平才能徹底治愈本病。水產動物源氣單胞菌的耐藥現象非常常見[17-18]，本研究結果也看到類似現象。益生菌、中草藥和寡糖防控凡納濱對蝦細菌病已有不少試驗和實踐驗證[19-21]，本研究中的防治試驗也證實了這些非抗菌藥物在防控細菌感染上的有效性。同時，筆者也發現部分發病池蝦在內服恩諾沙星、外用菌毒克后，能在給藥期間一定程度地控制死亡；但停藥后死亡率又有所反彈，直到水質調控良好、經微生態制劑和保肝利膽健脾中草藥調理好腸肝功能后，病情才徹底緩解。

因此，需要從病原、水環境和宿主3方面著手，做到控制水體病原菌數量和阻斷病菌入侵蝦體、維持良好的水環境(特別是菌藻平衡下的低氨氮和低亞硝酸鹽氮)以及做好蝦的腸肝保健，才能有效防控本病。