定生型和漂浮型銅藻的形態及超微結構觀察

朱 旗， 任繼銳,2， 陳娟娟， 楊 銳

(1. 寧波大學 浙江省海洋生物工程重點實驗室， 寧波 315211； 2. 浙江省漁業互保協會， 杭州 310006)

銅藻(Sargassumhorneri)，在分類學上隸屬于褐藻門、圓子綱、墨角藻目、馬尾藻科和馬尾藻屬[1]，是北太平洋西部特有的一種暖溫性大型底棲褐藻[2]。藻體黃褐色，有固著器、莖和葉3個部分，氣囊和生殖托頂生或生于葉腋中，藻體主干及分枝較細[3]。銅藻營底棲定生或漂浮生活。定生型銅藻生長在低潮帶深沼中或大干潮潮線以下4 m處的巖石上[3]，漂浮型銅藻可借助氣囊漂浮在海面，形成海藻床，為眾多海洋生物提供避敵、索餌、產卵、棲息生長的良好環境[4-6]。受到黑潮、千島寒流和中國海近岸水體運動等因素影響，銅藻在我國北起大連，南至雷州半島的沿海呈現不連續分布[7-8]。從生物量和分布區密集度分析，其分布中心應在浙閩沿海[9]。另外，在韓國和日本沿岸、美國加利福尼亞的長灘也報道有銅藻種群的分布[4]。銅藻是這些地區海藻床的重要組成部分，對當地海洋生態系統的形成和多樣性維持具有重要作用[10]。此外，銅藻在吸收CO2[11]修復水體富營養化和控制赤潮等方面具有優勢[12-13]，被海洋生態學家列為重建海藻場和實施海洋生態修復的重要物種之一[4]。

但是一旦水溫適宜銅藻生長，周圍海水中又富含磷酸鹽和硝酸鹽，也可能造成漂浮型銅藻暴發式增殖而引發新型藻類災害“金潮”，給沿岸養殖和環境造成危害[14]。2013年6月日照以東遠岸海域、2015年8月大連海濱和2017年1月鹽城都曾出現此類“金潮”，給當地海水養殖、旅游和船舶運輸等行業造成嚴重損失。當銅藻藻體大量解體后會導致局部海域水體富營養化，引發硅藻等其他生物量的異常暴發[15]，引發赤潮等其他生態環境災害。此外，由于海水溫度上升和近岸陸源污染等因素影響，定生型和漂浮型銅藻的種群數量和棲息空間也在發生變化。Komatsu等[10]依據目前海水溫度升高的速度預測定生型銅藻種群將逐漸從浙江沿海消失；銅藻的分布范圍將會北移，原有的海域將被較小的亞熱帶種所取代，到2099年前后中國東海和朝鮮半島的銅藻將消失。深入了解銅藻的漂浮生長機制和種群資源現狀，對于銅藻潮的防治和預警以及銅藻資源的健康、可控利用具有重要的意義。

關于銅藻的生長和暴發機制，目前的研究主要集中在銅藻生長和繁殖最適宜的溫度、光照強度和營養鹽等環境因素[16-17]和通過人工繁育技術來擴大定生型銅藻種群的規模[18]，而關于銅藻不同生態型的形態及結構的研究則鮮有報道。本實驗通過比較分析漂浮型和定生型兩種不同生態型銅藻在表觀、顯微和亞顯微結構上的異同點，為進一步探討銅藻漂浮機制提供基本數據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

本實驗所用材料定生型銅藻采集于溫州平陽縣南麂島的馬祖岙(27°27′N， 121°05′E)，漂浮型銅藻采集于南麂島的小虎嶼海灘上(27°28′N， 121°06′E)。樣品采集后用海水洗掉藻體上的附著藻類和生物，盡快放入保溫箱加冰袋帶回實驗室，用過濾消毒海水反復刷洗干凈，備用。

電子顯微鏡(Olympus DP70，北京瑞科中儀科技有限公司)；冷凍切片機(CM 1850 UV，廣州守誠貿易發展有限公司)；透射電鏡(日立H-7650，日立高新技術上海國際貿易有限公司)；PBS緩沖液(美國Irvine Scientific公司)；OCT冷凍切片包埋劑(美國Sakura公司)；戊二醛、無水乙醇和丙酮(國藥集團化學試劑有限公司，分析純)；鋨酸、Pon812環氧樹脂包埋劑(美國Spi-chem公司)。

1.2 形態觀察方法

1.2.1 取樣測量

分別取定生型銅藻和漂浮型銅藻(取自同一海域，不同藻團，每藻團隨機取出1株)各10株。隨機選取每株主枝上大致相同部位30 cm長度枝條，測量單位長度內分枝數、分枝節間長度、氣囊數目、生殖托個數，用SPSS16.0進行獨立樣本t檢驗統計分析和測量(分枝數、分枝長度、氣囊數、生殖托個數)。

1.2.2 冷凍切片

冷凍切片步驟：取新鮮銅藻組織用滅菌海水反復刷洗，濾紙擦拭組織塊后放入OCT包埋劑中至完全包埋，置于托物臺放入-20℃恒冷箱切片機中，10 min后進行恒冷箱切片，厚度在10 μm左右，選擇較完整的切片貼于載玻片上，在顯微鏡下觀察。

1.2.3 透射電鏡

Pon812環氧樹脂包埋制作：將新鮮組織剪切成小于1 mm的塊狀放入1.5 mL的離心管中，加入4%戊二醛固定2 h。用0.1 mol/L PBS浸洗3～4次，每次15 min。浸洗后，采用1%鋨酸固定1～2 h(黑暗處理)并用0.1 mol/L PBS浸洗3次。此后，分別用30%、50%、70%和90%酒精、90%丙酮和無水丙酮梯度脫水，每次15 min；丙酮和包埋劑滲透2 h后，吸出，并加入新的包埋劑，開蓋滲透過夜，第2天將組織進行包埋，放入烘箱中進行梯度聚合(37℃，12 h；60℃，48～72 h)，完全聚合后送樣切片。

2 結果與分析

2.1 形態數據分析

定生型和漂浮型銅藻在形態上具有顯著差異(圖1)。定生型銅藻固著器裂瓣狀，色澤深褐，氣囊少，雌生殖托粗短、雄生殖托細長，生殖托頂端無再生枝。漂浮型銅藻無固著器，色澤黃綠，主枝短，分枝多且短，生殖托頂端再生枝。

定生型銅藻的分枝節間長度和生殖托數目分別為漂浮型銅藻的1.68倍和5.08倍，而漂浮型銅藻的單位長度分枝數和氣囊數則分別為定生型銅藻的2.59倍和4.54倍(圖2)。經獨立樣本t檢驗分析，定生型銅藻和漂浮型銅藻的分枝長度差異極顯著(F=0.90，P<0.01)，兩者生殖托數差異極顯著(F=0.904，P<0.01)，分枝數差異極顯著(F=6.977，P<0.01)，氣囊數差異顯著(F=15.157，P<0.05)。結果顯示，在表型上定生型銅藻和漂浮型銅藻已存在極顯著差異，漂浮型銅藻為適應其漂浮生活在形態上已經進化為不同于定生型銅藻(圖1和圖2)，氣囊多是為了適應漂浮的生活，分枝多、生殖托少說明漂浮型主要依靠營養生長來擴增群體。這都符合藻潮物種的特點[19]。

銅藻的表觀形態是基因、外部環境和內部生理共同作用的結果[20]。據推測中國東海的漂浮銅藻最初可能來源于固著在海岸巖石上的定生型銅藻[21]，當藻體折斷后，殘枝利用氣囊的浮力隨著表面洋流漂浮在海面上，開始營漂浮生活并完成整個營養生殖過程[3]。在漂浮過程中，由于受到外部環境和內部生理的共同作用(如水溫、光和植物激素)，漂浮型銅藻在表觀上顯現分枝節間長度減少，單位長度分枝數和氣囊數增加，使其具備了暴發潛能，其生物量積累從幼苗長到2～3 m能在10個月內完成[6, 22]。

A：漂浮型銅藻生長狀態；B：漂浮型銅藻分枝、葉、氣囊狀況；C：漂浮型銅藻有再生枝的生殖托；D：漂浮型銅藻主枝末端變形；E：網繩上的定生型銅藻生長狀態；F：定生型銅藻小苗；G：定生型生殖托；H：定生型銅藻固著器

圖1 漂浮型銅藻和定生型銅藻
Figure 1 Floating and benthic types ofS.horneri

圖2 定生型銅藻和漂浮型銅藻測量數據差異分析Figure 2 Morphological differences between benthic type and floating type of S. horneri

2.2 顯微結構觀察

對定生型和漂浮型銅藻樣本進行冷凍切片觀察內部結構(圖3)。由圖3可知，定生型銅藻的固著器只有表皮和皮層細胞，無髓部細胞，表皮細胞含有大量色素體，皮層細胞大小幾乎均一、排列緊密，色素不明顯，此外還有不規則塊狀結構。兩種生態型銅藻的葉片和莖均由表皮、皮層和髓部3部分組成。其中，最外層的表皮細胞最小，含有大量色素體，向內依次為皮層細胞和髓部細胞。內外皮層由數層到十數層長橢圓形或長柱形細胞整齊排列而成。髓部由3～4層或4層以上大小不一的圓形細胞致密排列而成，細胞由外向內逐漸變大而所含色素則逐漸減少，故藻體由表皮向內部顏色越來越淺。通過細胞結構比較分析，發現定生型和漂浮型銅藻的葉和氣囊的內部構造基本相同。

2.3 超微結構觀察

通過細胞超微結構(圖4)比較，發現定生型和漂浮型銅藻的固著器、莖、葉片、氣囊和生殖托的表皮和皮層的亞顯微結構差異不明顯。

漂浮型銅藻沒有固著器，定生型銅藻的固著器僅有表皮和皮層，細胞致密排列，表皮細胞幾乎被藻泡(physode, Ph)充滿，此外還含有一些色素體(chloroplast, C)，皮層細胞的細胞壁很厚，但在2個細胞相連接處某點突然變薄，上面有許多小孔洞，這是皮層細胞間發達的胞間連絲(plasmodesmata, Pla)。

A1、A2：銅藻固著器；B1、B2：銅藻莖；C1、C2：銅藻葉片。a：表皮； b：皮層； c：髓部

圖3 銅藻的內部結構
Figure 3 Microstructure ofS.horneri

銅藻莖中的表皮細胞內含較多的藻泡(Ph)和色素體(C)，色素體多為周位，呈不規則形狀排列成兩排，此外還含有少量的液泡(vacuole, V)，皮層細胞的細胞核(cell nucleus, N)位于細胞中央偏側面，形狀不規則，色素體(C)較表皮細胞少，位于細胞周圍。皮層細胞之間亦存在有胞間連絲(Pla)。在定生型和漂浮型銅藻莖的皮層細胞外側都發現致密的絨毛樣結構(tomentum, T)，其功能尚不明確。

銅藻葉片細胞的表皮細胞僅有一層，色素體(C)卵圓形，多為周位，藻泡(Ph)內容物較零散，很少有大塊藻泡內容物出現，基本分布以細胞內近外圍為主，皮層細胞為數層近于橢圓形的薄壁細胞組成，皮層細胞之間亦存在有胞間連絲(Pla)。色素體(C)較表皮細胞少。

銅藻氣囊細胞的表皮細胞由長柱狀細胞緊密排列而成，色素體長橢圓形或長棒形，沿細胞內側底部排列成V字形，靠近藻體表面的細胞區，含較多藻泡(Ph)和液泡(V)。皮層細胞的細胞壁厚，由纖維組成，排列呈波紋，細胞之間有胞間連絲(Pla)，在胞間連絲處可以看到兩側細胞內容物的連續性。

銅藻生殖托細胞內細胞器豐富，核結構(N)明顯，色素體(C)含量比較多，藻泡(Ph)含量比較少。雌性生殖托和雄性生殖托的區別在于雌性生殖托還含有大量的線粒體(mitochondria, M)，并且雌生殖托在成熟時有卵囊。但本次實驗材料采集時生殖托尚未成熟放卵，因此未在雌性生殖托中發現卵囊結構。

在本研究的各類藻體細胞中都發現數量不一的同心層形結構(concentric lamini form structure, Cls)。王素娟在鐵釘紫菜、海帶和裙帶菜等藻類中都觀察到同心層結構[23]，目前尚無藻類中該結構的成分或功能的報道。結合動物細胞的特點[24]，作者推測該結構可能是藻類受到感染或藻體生理狀態變差，造成的細胞結構(如色素體或內質網等)凋亡或者解體而形成的。

A1、A2：定生型銅藻固著器；B1：定生型銅藻莖；B2：漂浮型銅藻莖；C1、C2：莖的絨毛樣結構；D1、D2：定生型銅藻葉片；E1、E2：漂浮型銅藻葉片；F：定生型銅藻氣囊；G：漂浮型銅藻氣囊；H1、H2：定生銅藻雄性生殖托；I1、I2：定生銅藻雌性生殖托；J1、J2：漂浮型銅藻雄性生殖托；K1、K2：漂浮型銅藻雌性生殖托。*Nu：nucleolus(核仁)

圖4 銅藻超微結構
Figure 4 Ultrastructure ofS.horneri

3 小結

本研究結果顯示漂浮和定生銅藻的藻體在表觀水平上具有顯著差異，而在顯微和亞顯微水平上兩類銅藻差異不明顯。漂浮型銅藻較定生型銅藻在表觀上顯現為分枝節間長度減少，單位長度分枝數和氣囊數增加；定生型銅藻的固著器沒有髓部細胞，莖和葉組織由外向里依次為表皮、皮層和髓部；表皮細胞比皮層細胞含有更多的藻泡和色素體，與顯微結構觀察到的藻體由表皮向里顏色越來越淺相一致；在銅藻的皮層細胞間廣泛分布著胞間連絲，且在胞間連絲處兩側細胞的內容物存在連續性。漂浮銅藻在表觀上的變化可能是對營漂浮過程中環境和內部生理(如水溫、光和植物激素)適應的結果。