水稻硝態氮響應的酵母雙雜交文庫的構建與分析

洪廣成, 陳 倩, 劉石鋒, 張漢馬, 秦小健

(重慶師范大學 生命科學學院 植物環境適應分子生物學市重點實驗室， 重慶 401331)

酵母雙雜交技術是Fields等首先創立的，是目前研究蛋白質與蛋白質之間相互作用的主要方法[1-3]。其原理是利用酵母特異轉錄激活因子GAL4(galactose-regulated upstream promoter element, GAL )具有DNA 特異結合域( DNA-binding domain )與轉錄激活結構域( transcription-activating domain )兩個彼此分離的結構域，兩個結構域之間相互獨立互不影響，但只有同時含有這兩個結構域時才能轉錄激活特定的表達基因，具有高效、簡便、高靈敏度等優點[4-7]。

水稻作為我國三分之二人口的主食，水稻產量的穩定與增收對于整個社會的穩定發展具有重要意義[8]。在過去的幾十年中，人工合成氮肥的出現極大地提高了水稻的產量[9]。但由于過量施肥和不科學的施肥方式導致了水體富營養化、環境污染和溫室效應等一系列生態問題的出現。因此在農業實際生產中, 大量施加的氮肥若不能被水稻高效吸收利用, 造成的資源損失和環境負面影響要比實際收益大得多[10-13]。

目前水稻產量受技術和養分的限制已到達瓶頸，需要從基因和其他方向做突破[14-15]。為了研究硝態氮響應條件下的相關水稻基因調控機理，本研究構建了水稻氮響應cDNA文庫，為后續研究提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 秈型雜交稻恢復系“9311”系中秈水稻品種(OryzasativaL.spp.indicavar.9311)。

1.1.2 主要試劑 “Mate & Plate”文庫構建試劑盒、PCR產物純化試劑盒、SD/-Leu、SD/-Leu/-Trp 和 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 購自Clontech 公司；質粒DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒購自TIANGEN公司；TRIzol?Reagent 購自Life Technologies 公司。

1.2 方法

1.2.1 水稻幼苗的培養與處理

用改良后不含氮素的霍格蘭營養液水培，以KNO3作為唯一氮源，在培養箱內先將已催芽的水稻種子放置于低氮(0.3 mmol/L)條件下培養15 d，再將其迅速轉移至高氮(5 mmol/L)水平條件下培養4 h后迅速提取處理材料的總RNA以備后用。

1.2.2 水稻總RNA的提取與檢測

將已處理的水稻組織放入加有液氮的研缽中研磨至粉狀，用Trizol提取法提取水稻的總RNA，具體步驟可參考Trizol試劑說明書。試驗所用的研缽經酒精灼燒，所用離心管、槍頭等均經過RNase free處理過，樣品擺放在冰面上，全程在超凈工作臺上操作，離心采用低溫離心機，防止提取過程中總RNA發生降解，最后將分離純化得到的總RNA用30 μL的DEPC水溶解。用BioDrop分光光度計測RNA濃度，并用濃度為 1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的 RNA 質量。

1.2.3 RNA反轉錄cDNA與檢測

建立反轉錄體系合成第一鏈 cDNA，以提取的水稻總RNA作為模板，CDS III(5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30VN-3′)為引物。再以合成的第一鏈cDNA為模板，使用長距離 PCR (LD-PCR) 擴增 ds cDNA。用CHROMA SPIN+TE-400 純化柱純化擴增的 ds cDNA，除去200 bp以下的小片段，具體步驟參考說明書 PT4085-1(Clontech)。用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測純化后的ds cDNA。

1.2.4 Y187酵母感受態制作

挑取劃線平板上生長最快的Y187酵母單克隆菌株用YPDA培養液擴大培養，并用分光光度計檢測菌液的OD600值，達到濃度后用1.1×TE/LiAc溶液制備建庫所需的感受態酵母，具體操作步驟參考說明書 PT4085-1(Clontech)。

1.2.5 構建cDNA文庫

用DMSO增強感受態酵母的細胞通透性，以高溫變性后迅速低溫處理的單鏈鮭魚DNA為攜帶載體，用熱激法將質粒載體pGBKT7-Rec和純化處理的雙鏈cDNA 共同轉入感受態酵母細胞。用YPD Plus Medium恢復處理轉化的酵母細胞后，再用15 mL 0.9%(W/V) NaCl溶液懸浮菌液，涂布于SD/-Leu培養基上，30℃倒置培養3 d后，用玻璃珠和冷凍液收集菌體，得到的酵母菌懸浮液即為構建的酵母雙雜交cDNA文庫；將菌液分裝在1.5 mL無菌離心管中，-80℃低溫保存，詳細步驟參照說明書 PT4085-1(Clontech)。

1.2.6 cDNA文庫轉化率及文庫大小的測定

從 15 mL 0.9% (W/V) NaCl 菌懸液中吸取100 μL菌液，稀釋10倍、100倍后分別吸取100 μL稀釋后的菌液涂布于 SD/-Leu 培養基上 30℃倒置培養 3 d，統計培養基上的單克隆菌落數計算轉化效率。取10 μL收集在冷凍液中的菌液稀釋102、104和106倍后，分別吸取100 μL涂布于SD/-Leu 培養基上30℃倒置培養3 d，統計平板上的單克隆菌落數計算文庫滴度。

1.2.7 cDNA文庫平均插入片段大小及重組率的計算

從計算轉化效率的SD/-Leu 培養基上隨機挑選20個單菌落擴大培養，提取酵母質粒DNA。以提取的質粒DNA為模板，pGADT7-Rec載體上游引物 Primer： 5′-CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCCA-3′，下游引物 Primer：5′-GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3′進行PCR 擴增。擴增程序：95℃預變性3 min； 95℃變性 30 s， 58℃退火 30 s， 72℃延伸 3 min，30個循環； 72℃再延伸10 min； 最后12℃保存。反應結束后用濃度1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 產物。

1.2.8 cDNA文庫平均插入片段的分析

從計算文庫滴度的培養基中隨機挑選10個單克隆，提取質粒后測序，并在NCBI上用Blast 功能對測序結果進行序列比對，尋找匹配序列。

2 結果與分析

2.1 總RNA 的提取

用Trizol提取法提取處理過的水稻材料9311的總RNA。將提取后的總RNA用濃度1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示28S及18S條帶清晰，5S條帶較弱(圖1)，RNA的完整性較好。經過分光光度計檢測，濃度約 2 μg/μL ，表明 RNA的質量較好，可用于下一步文庫的構建。

2.2 cDNA的合成與文庫的構建

取 2 μL 提取的總RNA為模板，反轉錄合成第一鏈cDNA，再以合成的第一鏈cDNA為模板，用LD-PCR體系擴增出ds cDNA，經濃度1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，ds cDNA的電泳條帶呈彌散狀，大小集中分布在 500～3000 bp 范圍內(圖2)。將合成的ds cDNA與載體pGADT7-Rec混合共轉化到感受態酵母菌Y187中得到cDNA文庫。 收集cDNA文庫的菌體，使用1.5 mL無菌離心管每管分裝1 mL后存放于-80℃備用。

圖1 總RNA電泳檢測

Figure 1 The electrophoresis of total RNA detection

圖2 ds cDNA 電泳檢測

Figure 2 The electrophoresis of total ds cDNA detection

圖3 計算文庫轉化效率SD/-Leu 培養基

2.3 cDNA 文庫的轉化效率及插入片段大小檢測

文庫轉化完成后加入 15 mL 0.9% (W/V) NaCl溶液懸浮菌液，吸取10 μL懸浮后的菌液稀釋100倍涂布于SD/-Leu 培養基上，30℃恒溫箱倒置培養3 d(圖3)。統計平板上的克隆數共215個，轉化效率計算公式：平板上的單克隆數×稀釋倍數×總轉化混合物體積/涂布體積 /3 μg pGADT7-Rec,計算得到轉換率為3.23×106/3 μg pGADT7-Rec滿足實驗需要的1×106/3 μg pGADT7-Rec。將收集在冷凍液中的 cDNA 文庫混合均勻，吸取 10 μL菌液稀釋100倍，再取10 μL稀釋后的菌液稀釋100倍，最后取10 μL稀釋兩次后的菌液稀釋100倍得到3種不同濃度的文庫，即原濃度的10-2、10-4和10-6。分別取100 μL稀釋后的文庫涂布于SD/-Leu 培養基上，30℃恒溫箱倒置培養3 d(圖4)。在稀釋至10-6的平板上平均長出17個單克隆菌落，文庫滴度(CFU/mL)= 單平板平均菌落數(17)/ 涂布體積(0.1 mL)×稀釋倍數(106)=1.7×108cfu/mL，滿足實驗所需滴度 2×107cfu/mL。從轉化效率的平板上隨機挑取20個單菌落進行 PCR 檢測只有1個未能擴增出相應的片段(圖5)，重組率達 95%； 插入片段長度介于500 ～1500 bp 之間，平均插入片段長度在1000 bp左右，文庫質量較好，可用于后續互作蛋白的篩選。

A、B、C：稀釋至10-2、10-4和10-6后的酵母菌懸液分別在文庫 SD/-Leu 平板上的生長情況，用于計算文庫滴度

圖4 不同濃度的 cDNA 文庫在 SD/-Leu 培養基上的生長情況

Figure 4 The growth of different concentrations cDNA library yeast on SD/-Leu medium

圖5 cDNA 文庫插入片段大小電泳檢測

2.4 cDNA 文庫插入片段分析

從文庫中隨機挑選10個克隆測序后，通過NCBI上Blast序列比對分析，共有9個克隆匹配到同源序列(表1)。其中除了2、6插入片段在序列比對時有部分堿基匹配錯誤，其他插入片段編碼順序均較匹配。

3 討論與結論

cDNA文庫的質量取決于文庫的代表性與完整性[16-17]，而完整性的體現需要總RNA的高質量提取，在提取過程中幾乎未發生RNA的降解，并且RNA高度純化無雜質。本試驗所用的總RNA經過純化處理后的電泳圖片28S和18S條帶清晰，表明總RNA的質量較高，可用于文庫的構建。

表1 測序匹配基因信息統計

本試驗使用的是Clontech 公司“Mate & Plate”文庫構建系統構建的水稻 cDNA文庫。用 SMART 技術合成的 ds cDNA 不需要對總RNA中的mRNA進行分離純化，因而避免了mRNA的降解損失；反轉的ds cDNA再通過 CHROMA SPIN TE-400 柱子的純化，去除小片段DNA，減少cDNA文庫在整合外源片段時產生的不利因素。同時利用同源重組的方法將與 pGADT7-Rec 載體末端同源的ds cDNA 定向重組到pGADT7-Rec 載體上，不僅可以有效避免繁瑣的酶切連接等步驟，同時也解決了連接的低效性和克隆的嵌合問題，從而保證了cDNA 文庫整合外源 ds cDNA 時的方向性和完整性[18]。通過轉化效率檢測的結果達到3.23×106/3 μg pGADT7-Rec滿足實驗所需條件，保證了試驗文庫的完整性和代表性。文庫的插入片段大小在1500 bp以下，說明大片段cDNA在同源重組時的效率較低，為以后的文庫構建提供經驗。

本試驗構建的水稻9311氮響應條件下的cDNA酵母文庫，cDNA文庫滴度1.7×108cfu/mL，插入的片段大小在500～1500 bp之間，文庫的質量符合篩選條件，可用于后續水稻氮吸收與利用關鍵基因互作蛋白篩選，為水稻氮素利用分子調控通路關鍵基因的挖掘提供幫助。