攜帶NMU2R shRNA重組腺相關病毒載體的構建及其評價

郭莉霞， 殷鐘意， 鄭旭煦

(1．重慶工商大學 環境與資源學院， 重慶 400067；2. 天然藥物研究重慶高校市級重點實驗室， 重慶 400067)

神經介素Neuromedin U(NMU)是20世紀80年代發現的一種神經調節肽，廣泛分布在垂體前葉、胃腸道、脊髓及兩性泌尿生殖系統，通過激活其受體[1]，發揮調節攝食和能量平衡、延緩胃排空和參與血壓和血流、下丘腦-垂體-腎上腺軸(The hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA axis)、免疫的調節等多種功能[2]。

在前期研究中，筆者應用以Luciferase為報告基因的Neuromedin U2 受體(Neuromedin U2 receptor，NMU2R)激動劑高通量篩選(High throughput screen)模型[3]，發現并證實辛弗林(Synephrine)是一種新型的NMU2R激動劑，它能夠特異性地激活NMU2R[4]。而由于結構與腎上腺素和去甲腎上腺素等內源性神經遞質相類似[5]，并且具有促進能量消耗、提高代謝、抑制攝食等作用，從而替代麻黃堿來發揮減肥功效。而辛弗林的這個作用有可能會是通過直接激活NMU2R，進而達到調節攝食和能量平衡。但到目前為止，還沒有獲得辛弗林激活NMU2R發揮減肥作用的直接證據。為了弄清NMU2R是否與辛弗林的減肥作用有直接聯系，本文中將詳細介紹攜帶大鼠NMU2RshRNA重組腺相關病毒(Adeno-associated Virus，AAV)載體的構建過程及其鑒定、評估，并將其轉染大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞，考察NMU2RshRNA基因沉默效果，為后續的研究提供實驗材料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及細胞株

質粒載體pAAV-ZsGreen-shRNA、JM109感受態細胞購自維諾賽生物；AAV-293 細胞、PC12細胞購自中國科學院細胞庫；小量質粒抽提試劑盒、Trans2K Plus II DNA Marker購自全式金生物；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自Omega公司；DNA引物合成、DNA測序、DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶購自invitrogen公司；限制性內切酶BamHI、限制性內切酶HindIII、限制性內切酶BglII、T4 DNA Ligase購自NEB公司；大規模質粒抽提試劑盒購自Qiagen公司；CPT高效轉染試劑盒、0.22 μm針頭濾器、Millex-HV 0.45 μm PVDF filters購自Millipore公司；ViraBindTMAAV Purification Kits購自Cell BioLabs公司；兔抗NUM2R單克隆抗體購自Merck Millipore公司；二抗購自北京中杉。

1.2 NMU2R shRNA的設計和構建

根據shRNA設計原則，設計編碼具有發夾結構的siRNA正義鏈和反義鏈的表達載體，在每條寡核苷酸鏈兩端加入用于酶切的BamH I和Hind III位點，具體DNA引物設計合成序列如下：NMU2R-F：5′-GATCCGAACACAGCAGCCAGGGACTCTGTCTTCCTGTCAACAGA GTCCCTGGCTGCTGTGTTATTTTTTAGATCTA-3′；NMU2R-R：5′-AGCTTGGCTGCTGTGTTCG-3′。該序列交由維諾賽生物負責合成鑒定。

1.3 重組質粒pAAV-ZsGreen-rNMU2R shRNA的構建與鑒定

將寡核苷酸單鏈100℃退火自然冷卻至室溫形成雙鏈DNA，退火產物分別用DEPC水稀釋100倍。利用限制性內切酶BamH I和Hind III雙酶切質粒載體pAAV-ZsGreen-shRNA，37℃水浴反應3 h，1%瓊脂糖凝膠電泳回收酶切大片段，然后利用T4 DNA連接酶將回收大片段與退火產物在22℃反應3 h，連接雙鏈DNA和質粒，構建pAAV-ZsGreen-rNMUR2 shRNA表達載體。常規制備JM109感受態細菌，并用重組載體進行轉化，LB培養板37℃恒溫培養箱倒置培養過夜，常規方法抽提質粒，然后用BamH I和Hind III進行酶切鑒定，酶切鑒定正確的克隆送去測序，測序引物：U6-F(5′-TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG-3′)。

1.4 rAAV5-ZsGreen-rNMU2R shRNA病毒包裝

按照CPT高效轉染試劑盒說明書，將含有pAAV-ZsGreen-rNMU2RshRNA的轉染體系均勻逐滴加入到AAV-293 細胞培養皿中，37℃，5% CO2培養箱培養6 h后，換新鮮培養基繼續培養60 h。期間在倒置顯微鏡下觀察細胞形態及熒光表達情況，觀察包裝效率。60 h后，分別收集細胞和上清液，-80℃/37℃反復凍融3次，3000 r/min離心10 min，收集上清，用0.45 μm PVDF膜過濾去除細胞碎片。病毒上清通過ViraBindTMAAV Purification Kits(Cell BioLabs，VPK-141)純化。

1.5 rAAV5-ZsGreen-rNMU2R shRNA病毒滴度的測定

取20 μL純化后的重組腺病毒，加入2 μL 無RNase的DNase，37℃水浴反應30 min，然后10 000 r/min離心10 min，取上清20 μL，加入80 μL稀釋緩沖液，沸水中煮沸10 min，冷卻至室溫。加入3 μL蛋白酶K，37℃水浴反應60 min，沸水繼續煮沸10 min，冰上放置冷卻。然后進行qPCR檢測，以重組腺病毒基因組的人NMU2R基因序列設計引物，上游引物為F：5′-TGGGAAGACAACCTGTAGGG-3′,下游引物為R：5′-GTGAAACCCCGTCTCTACCA-3′。pAAV-EGFP質粒做10、102、103、104和105稀釋后做標準曲線。PCR反應體系包括上下游引物各0.2 μL的100 μmol/L探針， 2 μL純化的病毒液/質粒，SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix(2×)5 μL，ddH2O 2.6 μL。PCR反應條件：50℃預變性2 min；95℃變性10 min，95℃退火30 s、60℃延伸30 s，40個循環。每個樣品設定3個重復測定管。

1.6 腺相關病毒感染PC12細胞以及靶基因NMU2R沉默效率的驗證

將處于對數生長期的大鼠嗜鉻細胞瘤細胞PC12分為3組，空白對照組、空載病毒組以及rAAV5-ZsGreen-rNMU2RshRNA(干擾組)。按照感染復數(Multiplicity of infection，MOI)計算所需加入病毒的體積數，感染24 h后收集細胞。采用Real-time PCR分析3組中NMU2RmRNA水平的變化。Western Blot分析轉染后NMU2R的蛋白表達水平。

1.7 統計學方法

2 結果與分析

2.1 pAAV-ZsGreen-rNMU2R shRNA質粒酶切鑒定

以鑒定正確的NMU2RshRNA退火形成雙鏈，與pAAV-ZsGreen-shRNA質粒BamH I和Hind III雙酶切產物相連接構建形成重組質粒pAAV-ZsGreen-rNMU2RshRNA，然后將雙酶切產物10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示酶切鑒定與預期結果相符，有目的重組載體，分別在5.0 kb和1.0 kb附近有單一的目的條帶(圖1)。測序結果顯示，這兩條目的重組載體分別為4780 bp和926 bp，pAAV-ZsGreen-rNMU2RshRNA測序結果與設計序列一致，重組質粒構建成功(圖2)。

1：Trans2K plus Ⅱ marker; 2：重組載體雙酶切產物條帶

圖1 pAAV-ZsGreen-rNMU2RshRNA重組質粒BamH I和Hind III雙酶切電泳圖

Figure 1 Electrophoretic map of recombinant plasmid pAAV-ZsGreen-rNMU2RshRNA

圖2 pAAV-ZsGreen-rNMU2R shRNA重組質粒測序圖

2.2 rAAV5-ZsGreen-rNMU2R shRNA病毒包裝純化及滴度檢測

pAAV-ZsGreen-rNMU2RshRNA的轉染體系與AAV-293細胞共培養后，倒置顯微鏡下觀察顯示，AAV-293細胞增殖旺盛，狀態良好，單個細胞呈不規則多角形貼壁生長，胞漿透亮，胞核隱約可見。熒光倒置顯微鏡下觀察到AAV-293細胞激發綠色熒光，熒光豐度高，表明腺相關病毒包裝成功(圖3)。經純化后用qPCR法測定rAAV5-ZsGreen-rNMU2RshRNA病毒滴度為1×1012vg/mL，滿足下一步體內外實驗需求。

1：轉染24 h后熒光圖; 2：轉染24 h后白光圖

圖3 pAAV-ZsGreen-rNMU2RshRNA質粒轉染AAV-293細胞圖

Figure 3 The expression of green fluorescence in AAV-293 cells transfected by recombinant plasmid pAAV-ZsGreen-rNMU2RshRNA

2.3 腺相關病毒感染PC12細胞以及靶基因NMU2R的沉默效率評價

用純化后的rAAV5-ZsGreen-rNMU2RshRNA感染PC12細胞，不同作用時間后，RT-PCR分析不同組的PC12細胞中NMU2RmRNA轉錄水平的變化。由圖4可知，感染24 h后，細胞內的NMU2RmRNA轉錄水平被顯著抑制(P<0.01)，抑制率達到了54 %，感染48 h后，抑制作用加強，抑制率增加到了77 %；而空載病毒組與空白對照組比較未見顯著性差異(P>0.05)。

與空白對照組比較，**P<0.01

圖4 PC12細胞內NMU2RmRNA轉錄水平

Figure 4 The transcription level ofNMU2RmRNA in PC12 cells

同時采用Western Blot檢測不同處理組的PC12細胞內NMU2R蛋白表達情況，結果如圖5所示，無論是轉染24 h還是48 h，與空白對照組比較，rAAV5-ZsGreen-rNMU2RshRNA(干擾組)NMU2R蛋白表達水平均顯著下降(P<0.01)，分別下降了43 %和74 %；而空載病毒組與空白對照組相比，NMU2R蛋白的表達未見差異(P>0.05)。

與空白對照組比較，**P<0.01

圖5 PC12細胞內NMU2R蛋白表達水平

Figure 5 The expression ofNMU2Rin PC12 cells

3 討論

盡管早期研究發現，人類中NMU2R主要分布在大腦中樞神經系統的黑質、延髓、腦橋的網狀結構、脊髓和丘腦這些特定區域[6]，但越來越多的研究證實，NMU2R的mRNA在消化器官[7-8]、淋巴系統和內分泌系統也有大量表達[8]，而且激活NMU2R顯示出重要的調節體重和攝食的作用[9]。有報道顯示，大鼠側腦室內給予NMU后，大鼠進食明顯地被抑制，進而體重減輕，并且總運動活性、體溫和能量代謝均有所增加[6,10-11]。另一方面，Egecioglu研究發現，特異性地敲除大鼠NMU2R后，顯著增加了對高脂飼料的攝取，體重也有所增加[12]。表明NMU2R是一個有效的攝食及能量平衡調節器。但是，體內受體功能的復雜性決定了要全面了解NMU2R的生理功能還需利用現代手段進行大量的藥理和分子實驗。

利用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術獲得某段特異性基因表達沉默是現在常用的分子手段[13]，構建穩定的RNAi表達載體與產生siRNA相應的DNA模板序列以及載體的選擇有密切關系。本實驗根據shRNA設計原則設計并合成了NMU2RshRNA序列，并選用AAV作為基因表達載體，不僅較非病毒性的質粒載體提高了感染效率，而且還利用AAV刪除其野生型的致病基因，從而降低了其免疫原性，提高了安全性。因此，本文利用重組腺病毒相關病毒rAAV5作為基因表達載體，以NMU2R干擾位點設計合成NMU2RshRNA干擾序列，經RT-PCR、酶切及測序驗證干擾序列，采用經典包裝方法最終獲得攜帶NMU2RshRNA重組腺相關病毒，并在此基礎上在大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞上考察了NMU2RshRNA基因沉默效果，為后續的研究提供了實驗材料。NMU2R的激活與調節攝食和能量平衡有密切關系，其生理功能的進一步研究和受體激動劑的廣泛篩選[14]，將可能為治療肥胖癥、糖尿病為代表的代謝性疾病提供有效的方法和手段。