光鑷技術(shù)在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀

李銀妹, 王浩威, 龔 雷

(中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué) 物理學(xué)院, 合肥 230026)

1986年A.Ashkin首次報(bào)道了用一束激光鉗制單個(gè)微粒[1]，成功演示了使用光鑷捕捉細(xì)胞，懸浮、拖動(dòng)細(xì)胞和亞細(xì)胞器[2-3]。激光光束引導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的生動(dòng)視頻展示了光鑷技術(shù)的奇特功能，從而激發(fā)了生命科學(xué)家的濃厚興趣和想象。他們用光鑷穿過(guò)細(xì)胞壁捉拿細(xì)胞器，收集染色體，加速染色體運(yùn)動(dòng)，等等[4-5]；特別是用光鑷技術(shù)首次觀測(cè)到單個(gè)分子馬達(dá)的運(yùn)動(dòng)[6-7]，為探索神秘的生命推動(dòng)力的本源拉開(kāi)了壯觀的序幕。光鑷技術(shù)的卓越表現(xiàn)，清楚地預(yù)示了這一新工具對(duì)推動(dòng)微觀生命科學(xué)研究的重要性。正如A.Ashkin所言，光鑷“將細(xì)胞器從它們正常位置移去的能力，為我們打開(kāi)了精確研究細(xì)胞功能的大門(mén)”。

30多年來(lái)，光鑷技術(shù)有了長(zhǎng)足的進(jìn)步，從單光鑷到多光鑷，光鑷與各種技術(shù)的結(jié)合，還有形形色色的新型光場(chǎng)光鑷不斷呈現(xiàn)[8]。光鑷在生命科學(xué)中的應(yīng)用探索取得了一個(gè)又一個(gè)開(kāi)創(chuàng)性的成果[8-11]，但是這些優(yōu)秀的成果主要出至少數(shù)物理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，純生物學(xué)家使用光鑷解決自己的生物學(xué)問(wèn)題還不多，光鑷技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域沒(méi)有得到很好的推廣。2018年光鑷技術(shù)榮獲諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)又一次激發(fā)了更多科學(xué)工作者的關(guān)注和興趣。我們實(shí)驗(yàn)室從光鑷發(fā)明以來(lái)一直從事光鑷技術(shù)及其在生命學(xué)科的應(yīng)用研究，對(duì)于光鑷技術(shù)及其應(yīng)用積累了一些經(jīng)驗(yàn)。撰寫(xiě)此文，力圖從物理與生物交叉的視角來(lái)討論光鑷技術(shù)的應(yīng)用。

1 光鑷技術(shù)

光鑷技術(shù)與許多現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)一樣，最初是與顯微鏡結(jié)合產(chǎn)生的，光鑷使顯微鏡增加了兩項(xiàng)功能。第一，能主動(dòng)操控顯微鏡下觀測(cè)到的細(xì)胞，在物鏡的工作距離范圍內(nèi)操控細(xì)胞；第二，增加了力的測(cè)量指標(biāo)，用于測(cè)量細(xì)胞與細(xì)胞之間，細(xì)胞與環(huán)境物質(zhì)的相互作用力。光鑷在微納米尺度的生命科學(xué)領(lǐng)域提供了一個(gè)新的研究工具。我們通常泛指的“光鑷”(不特殊說(shuō)明)是能直接操控細(xì)胞的光場(chǎng)，因?yàn)榧?xì)胞及其生存環(huán)境恰恰符合這種光鑷的設(shè)計(jì)。

1)技術(shù)特點(diǎn)?！肮忤嚒笔且环N特殊結(jié)構(gòu)的三維梯度光場(chǎng)，只有光場(chǎng)與物質(zhì)相互作用時(shí)才顯示其“鑷子”的功能?？梢?jiàn)要實(shí)現(xiàn)光控制物體，物體的光學(xué)性質(zhì)必須符合光鑷光場(chǎng)的要求，反之需要按照被操控的物體光學(xué)性質(zhì)設(shè)計(jì)光場(chǎng)。如圖1-A所示，當(dāng)細(xì)胞的折射率大于液體的折射率時(shí)，一束強(qiáng)匯聚的光線通過(guò)液體進(jìn)入細(xì)胞發(fā)生折射的過(guò)程將光動(dòng)量傳遞給了細(xì)胞，細(xì)胞產(chǎn)生的反作用力的合力逆光線傳播方向，在空間三維將細(xì)胞推向焦點(diǎn)。由于細(xì)胞比較脆弱，以往在顯微鏡下只能觀察卻無(wú)法直接作用它，有了光鑷，我們通過(guò)光場(chǎng)懸浮細(xì)胞，移動(dòng)光束就可以在顯微鏡下操控細(xì)胞。光鑷操控細(xì)胞是光場(chǎng)整體與細(xì)胞的作用，避免了機(jī)械力鉗有著力點(diǎn)對(duì)它的傷害。無(wú)形的光鑷還有“隔墻取物”之功能，即穿過(guò)組織或細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行“手術(shù)”。

2)工作方式。光鑷對(duì)物體的操控有兩種形式。一種是“直接操控”，如圖1-B所示，即細(xì)胞被囚禁在光阱中，移動(dòng)光阱或移動(dòng)細(xì)胞所在樣品池，使細(xì)胞與周?chē)沫h(huán)境產(chǎn)生相對(duì)運(yùn)動(dòng)實(shí)現(xiàn)操控的目的。納米尺度的單分子超出了光學(xué)顯微鏡的分辨范圍，人們將待測(cè)單分子通過(guò)生化“偶聯(lián)”的方法與微米小球連接[12-13]，如此實(shí)現(xiàn)“間接操控”單分子的目的。如圖1-C所示，DNA的兩頭分別與玻片和小球偶聯(lián)，光鑷通過(guò)小球?qū)崿F(xiàn)拖拽DNA的目的。間接操控方法通常用來(lái)進(jìn)行分子間相互作用發(fā)生的位移測(cè)量，通過(guò)小球偏離光阱中心的位移量或細(xì)胞的形變量等基本信息，提供精確計(jì)算使之產(chǎn)生位移或形變所需要的外力。

3)測(cè)力方法。光捕獲細(xì)胞是對(duì)細(xì)胞施加了pN(10-12N)量級(jí)的作用力，光力值測(cè)量有兩種方法。一種根據(jù)流體力學(xué)中(在沒(méi)有渦流情況下)的Stokes公式：

Fc=6πηaυ

(1)

其中η為液體黏滯系數(shù)，a為細(xì)胞半徑，通過(guò)測(cè)量細(xì)胞相對(duì)于周?chē)后w的速度υ，計(jì)算得到光阱力。

圖1 光鑷原理和光操控

鑒于光阱具有類(lèi)似于彈簧的性質(zhì)，如圖2所示，其中k代表彈性系數(shù)，稱(chēng)為光阱剛度。當(dāng)我們將細(xì)胞拽離光阱時(shí)，測(cè)量細(xì)胞偏離光阱中心的距離x，已知光鑷系統(tǒng)的k值，即可求出細(xì)胞所受外力的大小。

F=-kx

(2)

圖2 光阱剛度

可見(jiàn)，光鑷研究生物分子，其中涉及單分子與小球的生化偶聯(lián)技術(shù)，小球位移量的測(cè)量，以及通過(guò)位移計(jì)算光阱力。實(shí)驗(yàn)所獲得的位移和力是純物理量，它們定量地反映了細(xì)胞或單分子行為的生物學(xué)功能，由此將逐步破譯生命如何由單分子形成聚集體，組建成細(xì)胞來(lái)創(chuàng)造生命單元以及協(xié)調(diào)生命運(yùn)動(dòng)的。

2 光鑷技術(shù)的發(fā)展

A.Ashkin在發(fā)明光鑷的同時(shí)就建立了光鑷儀器的雛形。30多年來(lái)在應(yīng)用的驅(qū)動(dòng)下，光鑷技術(shù)從微米精度發(fā)展到了納米精度的操作與探測(cè)；由單光鑷到多光鑷集成，從線性光鑷到旋轉(zhuǎn)光鑷乃至基于空間光調(diào)制的全息光鑷，以光纖為傳導(dǎo)的光纖光鑷，倏逝波近場(chǎng)光鑷，根據(jù)微粒的物理特性設(shè)計(jì)的復(fù)雜光場(chǎng)特殊光鑷，等等，已形成了形形色色的光鑷大家族。光鑷技術(shù)能方便地與其他多種光學(xué)技術(shù)銜接，如在激光微束、熒光激發(fā)、共焦掃描顯微鏡、喇曼光譜儀等專(zhuān)有技術(shù)中集成[8]。特別是光鑷與高分辨率成像以及數(shù)字圖像分析[14]，單分子熒光技術(shù)的結(jié)合[15]，各種數(shù)據(jù)處理和算法等形成了一種強(qiáng)大的用于單分子研究的技術(shù)平臺(tái)。

1)單分子光鑷力譜儀。高精度的光鑷儀器是傳統(tǒng)技術(shù)和現(xiàn)代科技綜合高度集成的系統(tǒng)，它涉及光學(xué)操控與成像、驅(qū)動(dòng)及反饋控制、頻譜分析、噪聲抑制技術(shù)等較廣泛的專(zhuān)業(yè)領(lǐng)域。實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)包括硬件、數(shù)據(jù)處理和控制軟件、信號(hào)探測(cè)方法、數(shù)據(jù)處理算法、樣品制備技術(shù)等。為了亞納米的空間分辨和ms的時(shí)間分辨，光鑷系統(tǒng)務(wù)必對(duì)各種噪聲來(lái)源要進(jìn)行分析和去噪，目前雙光鑷法已達(dá)到布朗噪聲的極限[16]。該領(lǐng)域一直不斷移植先進(jìn)的信號(hào)處理方法，探究新的測(cè)量技術(shù)以提高光鑷系統(tǒng)的穩(wěn)定性和測(cè)量精度。圖3為本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)多年升級(jí)研制的高精度、高穩(wěn)定的單分子光鑷實(shí)驗(yàn)裝置。系統(tǒng)設(shè)計(jì)為雙光鑷，光阱剛度1500 pN/μm;位移精度為1.1 nm；力的測(cè)量精度為0.1 pN；時(shí)間分辨力約為4 μs。系統(tǒng)引入探測(cè)光以提高信號(hào)探測(cè)精度并降低系統(tǒng)噪聲；原味標(biāo)定電壓系數(shù)；利用圖像識(shí)別進(jìn)行反饋以補(bǔ)償系統(tǒng)漂移；建立包括監(jiān)控、標(biāo)定、拉伸和恒力等功能在內(nèi)的模塊化操控軟件，創(chuàng)造優(yōu)良的穩(wěn)定性和便捷有效的操作環(huán)境。

圖3單分子光鑷力譜儀

圍繞光鑷研究單細(xì)胞單分子，還需掌握必要的常規(guī)生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)，建立手柄小球與分子偶聯(lián)技術(shù)、樣品室的制備、玻片清洗等交叉研究的關(guān)鍵技術(shù)。光鑷只是單分子研究的核心技術(shù)，在生物交叉研究中還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。通過(guò)不同的表征手段和數(shù)據(jù)，采取交叉思維的方式，從多視角進(jìn)行跨學(xué)科研究形成正確完整的認(rèn)識(shí)，這也是當(dāng)今生物物理領(lǐng)域研究的特點(diǎn)。

2)研究生物組織內(nèi)細(xì)胞的光鑷技術(shù)。動(dòng)物活體內(nèi)細(xì)胞的非損傷性捕獲和力的測(cè)量可用于探測(cè)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能、分析細(xì)胞之間以及細(xì)胞與組織之間的相互作用，從而幫助揭示細(xì)胞病變的機(jī)理、腫瘤細(xì)胞遷移等特性，對(duì)生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床醫(yī)學(xué)具有重大意義[17]。光鑷技術(shù)發(fā)展幾十年，基本上是體外研究細(xì)胞。直到2013年，我們首次成功嘗試?yán)霉忤囍苯硬僮骰铙w小鼠耳朵毛細(xì)血管內(nèi)單細(xì)胞和跟蹤觀察單細(xì)胞的活動(dòng)[18]，開(kāi)拓了光鑷研究活體內(nèi)細(xì)胞新領(lǐng)域(圖4)。繼續(xù)沿著活體研究方向主要有兩方面的內(nèi)容。

圖4 光鑷操控小白鼠毛細(xì)血管中的血細(xì)胞

①組織內(nèi)深度細(xì)胞的光鑷操控和力的測(cè)量技術(shù)。針對(duì)動(dòng)物活體組織的特點(diǎn)，全面探尋光鑷研究活體的有效實(shí)驗(yàn)方法和相關(guān)參數(shù)。例如，血細(xì)胞是在一定壓力的流體中運(yùn)動(dòng)，光力的測(cè)量需要通過(guò)理論和實(shí)驗(yàn)研究，重新提出相適宜的測(cè)量方法。例如，動(dòng)物活體內(nèi)淋巴結(jié)中的細(xì)胞是密集狀態(tài)的，如何在密集細(xì)胞中控制單個(gè)細(xì)胞，研究細(xì)胞間的相互作用。還有，在生物組織內(nèi)光鑷對(duì)操作細(xì)胞的安全性，諸如此類(lèi)的問(wèn)題，需要通過(guò)活體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行全面的論證，這是物理學(xué)下一階段重點(diǎn)研究?jī)?nèi)容。

②活體組織深度細(xì)胞的光捕獲技術(shù)。光捕獲的基本要求是激光能有效匯聚形成光阱，同時(shí)能夠觀測(cè)目標(biāo)物體，即對(duì)物體成像。對(duì)于動(dòng)物組織內(nèi)細(xì)胞，光穿過(guò)百微米深度以后，生物組織對(duì)光的強(qiáng)烈散射使得光束無(wú)法匯聚形成光阱。為了解決光透過(guò)生物組織的光散射問(wèn)題，我們又要折回到純物理學(xué)研究領(lǐng)域。生物組織屬于復(fù)雜介質(zhì)，并且活體需要實(shí)時(shí)快速測(cè)量，我們提出“基于復(fù)雜介質(zhì)波前矯正的活體動(dòng)物內(nèi)細(xì)胞的實(shí)時(shí)捕獲與成像”研究，物理學(xué)家又面臨極大的挑戰(zhàn)。

3 光鑷研究單細(xì)胞的應(yīng)用

細(xì)胞是生命的基本單元，對(duì)細(xì)胞的深入研究是揭開(kāi)生命奧秘、改造生命和征服疾病的關(guān)鍵。操控細(xì)胞或細(xì)胞器是光鑷最基本的功能，我們可以充分利用光能“鉗”住細(xì)胞的特點(diǎn)，通過(guò)操控、搬運(yùn)、分選、牽拉等簡(jiǎn)單的動(dòng)作，完成以往難以實(shí)現(xiàn)的生物學(xué)研究。

1)動(dòng)物活體內(nèi)控制細(xì)胞[18]。直接對(duì)活體動(dòng)物進(jìn)行研究，能夠?qū)崟r(shí)觀測(cè)和操控其體內(nèi)的細(xì)胞，是生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究者和醫(yī)生臨床診斷夢(mèng)寐以求的研究手段。我們采用醫(yī)用模式動(dòng)物小白鼠為研究對(duì)象，將小鼠經(jīng)過(guò)麻醉、刮毛、固定在光鑷設(shè)備的操控平臺(tái)上后形成活樣本，如圖4所示。用單光鑷捕獲住小鼠耳朵深度約50 μm 處毛細(xì)血管中的細(xì)胞。將光鑷固定放在血管中心，在光場(chǎng)的干擾下，血管中流動(dòng)的細(xì)胞速度逐漸變緩，細(xì)胞變少，約4 s時(shí)一個(gè)細(xì)胞穩(wěn)定在光阱中。光鑷控制該細(xì)胞，在血管的有限空間實(shí)現(xiàn)了三維的操控，如圖4-a、b、c所示。圖4為光鑷研究活體小白鼠實(shí)驗(yàn)圖和在血管中捕獲細(xì)胞的示意圖; a、b、c為光鑷在流動(dòng)的血液中控制單個(gè)細(xì)胞。光鑷成功地在動(dòng)物血管中控制了血細(xì)胞，我們繼續(xù)展示了當(dāng)毛細(xì)血管中血紅細(xì)胞聚集堵塞形成“血栓”時(shí)，光鑷鉗制住細(xì)胞群邊緣一個(gè)紅細(xì)胞，拖拽其脫離群體順著血管移動(dòng)；同時(shí)在血管的壓力下，其他細(xì)胞也追逐之后運(yùn)動(dòng)，使得被堵塞的血管很快恢復(fù)正常流動(dòng)。整個(gè)“手術(shù)”僅用時(shí)約37 s。反之亦然，利用光陷阱效應(yīng)實(shí)施血管中的細(xì)胞聚集，可造成血栓堵塞血管的效果。將光鑷技術(shù)首次應(yīng)用在動(dòng)物血管中自如控制細(xì)胞[18]，利用光陷阱制造“血栓”，或通過(guò)牽引細(xì)胞脫離聚集體，使堵塞的血管逐漸恢復(fù)流動(dòng)。AsianScientist醫(yī)學(xué)研究欄目以“用光清除被堵塞的毛細(xì)血管” 標(biāo)題，展望了該技術(shù)的醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用前景(https://www.asianscientist.com/2013/04/in-the-lab/clearing-blocked-capillaries-laser-beam-2013/)。

2)控制生物體內(nèi)的平衡石?！捌胶馐僬f(shuō)”表明每種生物都有重力感受器，植物細(xì)胞的重力感受器是根冠平衡細(xì)胞中的淀粉體，即植物生長(zhǎng)平衡因子，哺乳動(dòng)物感重器官是腦前庭系統(tǒng)中的耳石。通過(guò)光鑷操控生物細(xì)胞內(nèi)平衡石的實(shí)驗(yàn)證明，利用光鑷可以完成之前那些需要在衛(wèi)星上才能進(jìn)行的微重力研究。圖5-A為光鑷移動(dòng)栗藻假根細(xì)胞頂端中的淀粉粒的位置，細(xì)胞偏離原來(lái)的生長(zhǎng)方向[19]。圖5-B為光鑷控制斑馬魚(yú)耳石模擬前庭行為[20]，紅圈指示耳石。動(dòng)物的前庭行為(Vestibular behaviours)用于檢測(cè)重力和運(yùn)動(dòng)，關(guān)系到個(gè)體的生存，但是我們目前還不清楚神經(jīng)系統(tǒng)是如何處理前庭運(yùn)動(dòng)信息的。Favre-Bulle等人用光鑷給靜止的斑馬魚(yú)耳石(otoliths)施力的方法來(lái)模擬前庭刺激，同時(shí)觀察斑馬魚(yú)的行為變化，分析了前庭刺激與行為變化之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，光鑷對(duì)斑馬魚(yú)耳石的內(nèi)側(cè)和外側(cè)施加力會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)尾巴朝著相反的方向擺動(dòng)，光鑷對(duì)斑馬魚(yú)耳石施力越大尾巴擺動(dòng)的幅度也越大。當(dāng)對(duì)耳石外側(cè)施力時(shí)，可同時(shí)觀測(cè)到斑馬魚(yú)的兩眼在做相反方向的轉(zhuǎn)動(dòng)。

A：栗藻假根細(xì)胞[19]；B：光鑷控制斑馬魚(yú)耳石模擬前庭行為[20]

A：Rhizoid direction change due to statolith displacement by optical tweezers; B:Optical tweezers stimulates the zebrafish vestibule through the otolith

圖5 光鑷控制生物體內(nèi)的平衡石

Figure 5 Optical tweezers manipulate force-sensitive structure inside organism

3)從細(xì)胞中提取單條染色體[21]。水稻基因組包含12對(duì)染色體，將混合測(cè)序的結(jié)果分別定位到每條染色體上需要花費(fèi)大量時(shí)間和經(jīng)費(fèi)。由于12條水稻染色體較小外形區(qū)別不大，流式細(xì)胞儀無(wú)法有效分辨。我們利用脈沖激光刀破壞水稻細(xì)胞膜釋放染色體，然后用光鑷捕獲單條染色體，將其從染色體群和細(xì)胞殘骸中分離出來(lái)。由于提取得到的是單條染色體，因此避免了多種染色體測(cè)序混淆的問(wèn)題，在基因組測(cè)序和基因工程應(yīng)用中具有重要意義。

a、b為明場(chǎng)照明，c、h為熒光觀測(cè)；十字為光阱。a為水稻細(xì)胞，b為細(xì)胞被紫外光激發(fā)下破裂;c為熒光觀測(cè)釋放的染色體；d～f為光鑷夾持一個(gè)染色體使其從群體中分離出來(lái)；g～h為光鑷將染色體移至微吸管管口，利用微吸管的毛細(xì)效應(yīng)收集單條染色體

圖6 光鑷分選單條染色體

Figure 6 Isolating single rice chromosome with optical tweezers

實(shí)驗(yàn)得到了20余個(gè)單條染色體樣品，經(jīng)PCR 擴(kuò)增，DNA序列測(cè)量，同源性比較等生化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，光學(xué)微操作分選的是水稻單條染色體，部分片段為水稻1號(hào)染色體(圖6)。光鑷分選單條染色體分離全過(guò)程處于視屏監(jiān)控之下，分離得到的是100%的單條染色體。該方法具有無(wú)損傷、無(wú)污染、選擇性高、分選微粒尺度小等優(yōu)點(diǎn)。光鑷直接從活體細(xì)胞內(nèi)提取，是最原始的染色體俘獲與分離方法，該方法適用于任何植物和動(dòng)物細(xì)胞中染色體的分選。

4)探測(cè)細(xì)胞質(zhì)的黏彈性?；诠獾拇┩柑匦?，光鑷透過(guò)細(xì)胞膜深入其內(nèi)部操控牽拉細(xì)胞器，改變速度和力的大小，作為探針探測(cè)細(xì)胞質(zhì)的黏稠度和彈性，如圖7所示。原生動(dòng)物在樣品室底面自由運(yùn)動(dòng)時(shí)，光阱瞄準(zhǔn)原生動(dòng)物，抓住了位于原生動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的圓形細(xì)胞器(P點(diǎn))，當(dāng)原生動(dòng)物自由前進(jìn)時(shí)，被光阱捕獲的細(xì)胞器被拉向細(xì)胞的后部。實(shí)驗(yàn)顯示了細(xì)胞器內(nèi)細(xì)胞質(zhì)的黏滯性。

上圖為操控原生動(dòng)物內(nèi)細(xì)胞器，箭頭指示細(xì)胞運(yùn)動(dòng)方向，P指示光鑷捕獲細(xì)胞內(nèi)部的細(xì)胞器；下圖為光鑷操控水綿細(xì)胞體內(nèi)顆粒

圖7 探測(cè)細(xì)胞質(zhì)的黏彈性[2]

Figure 7 Detecting viscosity and elasticity of cytoplasm[2]

當(dāng)原生動(dòng)物體沿著箭頭方向運(yùn)動(dòng)時(shí)(圖7-a、b)，細(xì)胞器被光鑷束縛離開(kāi)了原來(lái)的位置，逆箭頭方向運(yùn)動(dòng)；最后，由于原生動(dòng)物體的運(yùn)動(dòng)速度大于光鑷力，細(xì)胞器碰到細(xì)胞壁后從光阱掙脫出來(lái)，然后彈回到位置F處(圖7-d)，但離初始位置P尚有一段距離。光鑷在水綿(sporigyra)細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)層中操縱一小簇流動(dòng)細(xì)胞，這些細(xì)胞被逆著箭頭所示路徑移動(dòng)，并且穿過(guò)水綿上部細(xì)胞壁附近的淀粉核和葉綠體。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)光鑷作為外力牽拉細(xì)胞器，松開(kāi)后它又立刻彈回去，就像系在一個(gè)彈性繩上。光鑷力可作為細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的探針。

基于現(xiàn)有的光鑷技術(shù)可深入活體百微米的深度，利用斑馬魚(yú)模式動(dòng)物，可以開(kāi)展的動(dòng)物活體內(nèi)細(xì)胞研究(圖3～圖7)[18, 20, 22]。因?yàn)檫@方面研究的光鑷儀器相對(duì)簡(jiǎn)單，生物學(xué)家可以把精力集中在生物學(xué)問(wèn)題上。與此同時(shí)，物理學(xué)家也將在光場(chǎng)研究的角度上盡量從技術(shù)上拓寬光鑷操控的深度，如研究活體組織與油浸物鏡的折射率不匹配問(wèn)題，采取光學(xué)補(bǔ)償?shù)姆椒ㄌ岣咻S向捕獲深度等[23]。我們展望這將是光鑷技術(shù)獲得推廣應(yīng)用比較快的一個(gè)切入點(diǎn)。

4 物理和生物交叉研究的特點(diǎn)

光鑷技術(shù)面對(duì)生命科學(xué)問(wèn)題，研究細(xì)胞和生物大分子，測(cè)量納米尺度運(yùn)動(dòng)變化，對(duì)物理學(xué)在觀念、方法、技術(shù)上是一個(gè)全面的挑戰(zhàn)，對(duì)生物學(xué)家如何理解物理的測(cè)量結(jié)果，解釋生物學(xué)問(wèn)題也是一個(gè)全新的課題。

1)宏觀與微觀。光鑷研究的生物對(duì)象多為微米和納米尺度的細(xì)胞和單分子，宏觀和微觀下起主導(dǎo)作用的物理規(guī)律有時(shí)并不相同。如擴(kuò)散系數(shù)、黏滯系數(shù)等物理參數(shù)也會(huì)因?yàn)槌叨鹊淖兓l(fā)生變化。物理學(xué)家需要克服從宏觀向微觀轉(zhuǎn)換的理論和技術(shù)難題，比如微納米尺度下流體的摩擦阻力起主導(dǎo)作用，黏滯阻力在分析生物物理現(xiàn)象中非常重要，這些特性決定了細(xì)菌如何使用分子馬達(dá)驅(qū)動(dòng)纖毛或者鞭毛產(chǎn)生移動(dòng)等生物功能。宏觀世界不予考慮的熵力在微觀世界也不可忽視，如DNA的長(zhǎng)鏈大分子在光鑷作用下的力伸展曲線完全由熵力所決定，當(dāng)DNA與其他分子產(chǎn)生相互作用時(shí)，熵變也直接影響力的測(cè)量。微觀環(huán)境中無(wú)規(guī)則熱運(yùn)動(dòng)和漲落非常明顯，因此單次測(cè)量得不到確定的值。例如DNA環(huán)的壽命分布、微球在光鑷中心的位置分布，以及打開(kāi)RNA結(jié)構(gòu)所需要的外力等，需要進(jìn)行多次測(cè)量，并從統(tǒng)計(jì)角度對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

2)物理數(shù)據(jù)與生物問(wèn)題。如何把物理手段測(cè)量得到的數(shù)據(jù)與生物學(xué)問(wèn)題聯(lián)系起來(lái)，是生物物理交叉學(xué)科的核心。光鑷測(cè)量得到的是力和長(zhǎng)度等物理量，但生物學(xué)是通過(guò)自由能和結(jié)構(gòu)變化來(lái)理解分子的生物功能。因此，生物物理研究需要將物理測(cè)量結(jié)果與分子結(jié)構(gòu)和生化反應(yīng)聯(lián)系起來(lái)才能用來(lái)解譯生物學(xué)問(wèn)題。如何理解物理實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)曲線解譯生物問(wèn)題，這是需要生物物理共同理解和翻譯的過(guò)程，也是合作交叉研究的核心部分。張曉輝等利用光鑷研究vWF蛋白是一個(gè)典型的例子[24]。

(a)為蛋白結(jié)構(gòu)和實(shí)驗(yàn)原理，A和B球分別鏈接vWF蛋白的兩端，微針固定b微球，光鑷牽拉A球進(jìn)行測(cè)量；(b)為vWF蛋白被打開(kāi)的拉伸力-時(shí)間曲線；(c)為vWF蛋白被打開(kāi)的拉伸力-伸長(zhǎng)量；(d)為vWF蛋白分子結(jié)構(gòu)示意圖

圖8 光鑷研究vWF蛋白[24]

Figure 8 Study vWF protein using optical tweezers[24]

vWF蛋白是內(nèi)皮細(xì)胞制造的一種大分子蛋白，在體內(nèi)ULvWF蛋白會(huì)被ADAMTS13切割成小塊的vWF，這個(gè)受到嚴(yán)密調(diào)控的切割過(guò)程如果發(fā)生紊亂就會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的血栓或者出血疾病。人們認(rèn)為血液流動(dòng)產(chǎn)生的剪切力是ULvWF切割過(guò)程的調(diào)控因素，但生化技術(shù)難以了解剪切力調(diào)控蛋白切割過(guò)程背后的調(diào)控機(jī)制。利用光鑷施加的皮牛力打開(kāi)vWF的A2區(qū)域的實(shí)驗(yàn)顯示，如圖8-b所示，只有當(dāng)外力將A2結(jié)構(gòu)打開(kāi)時(shí)，vWF才能夠被ADAMTS13切開(kāi)。進(jìn)一步的物理計(jì)算表明vWF蛋白受到流體剪切力與蛋白的大小和流場(chǎng)分布有著密切的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人信服地將流場(chǎng)和蛋白大小與vWF的結(jié)構(gòu)變化聯(lián)系了起來(lái)，并證明了這種結(jié)構(gòu)變化與ADAMTS13的切割效率之間的關(guān)系。

從圖8可以看出，生物物理從力和長(zhǎng)度的測(cè)量開(kāi)始，通過(guò)模型分析和理論計(jì)算，把測(cè)量結(jié)果與分子結(jié)構(gòu)變化和生化反應(yīng)效率聯(lián)系起來(lái)，才能最終給出生命學(xué)現(xiàn)象的解釋。尋找合適的生命科學(xué)問(wèn)題，以及將生命學(xué)現(xiàn)象和實(shí)驗(yàn)上能夠測(cè)量得到的物理參數(shù)聯(lián)系起來(lái)是生物物理研究取得成功的關(guān)鍵。

類(lèi)似的例子還有很多。如光鑷研究SSB蛋白[25]，當(dāng)DNA受到損傷或者復(fù)制發(fā)生錯(cuò)誤時(shí)生物體有一系列的措施對(duì)其進(jìn)行修復(fù)。一種常見(jiàn)的修復(fù)機(jī)制是將雙鏈DNA中錯(cuò)誤的部分清除，然后用正確的單鏈DNA重新復(fù)制。在復(fù)制開(kāi)始之前生物體會(huì)將單鏈DNA纏繞在SSB蛋白上保護(hù)起來(lái)，在修復(fù)過(guò)程中有序釋放出來(lái)。因此SSB蛋白與單鏈DNA的相互作用過(guò)程就成為DNA修復(fù)的關(guān)鍵。利用FRET熒光信號(hào)，將光鑷測(cè)量到的DNA長(zhǎng)度變化和SSB-DNA復(fù)合體的結(jié)構(gòu)變化聯(lián)系起來(lái)，從而分辨出SSB蛋白在單鏈DNA上纏繞和滑動(dòng)兩種不同的運(yùn)動(dòng)模式，為理解DNA修復(fù)過(guò)程提供幫助。這是將兩個(gè)單分子技術(shù)結(jié)合起來(lái)，用光鑷測(cè)量到的長(zhǎng)度變化與蛋白-DNA復(fù)合體結(jié)構(gòu)變化聯(lián)系起來(lái)的例子。

3)單分子偶聯(lián)。多年來(lái)光鑷研究單分子的實(shí)踐表明，一個(gè)是否符合光鑷裝備操作的生物樣品制備的難易、成功與否，幾乎決定了合作研究能否繼續(xù)下去。每次針對(duì)不同的生物問(wèn)題，光鑷研究單分子將提出相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方案，樣品的設(shè)計(jì)是其重要環(huán)節(jié)，我們?cè)趩畏肿訙y(cè)力的文獻(xiàn)中幾乎都會(huì)看到作者描述如圖8-a所示的光鑷研究待測(cè)分子實(shí)驗(yàn)方案。

圖9顯示的是我們用光鑷研究RNA結(jié)構(gòu)的分子偶聯(lián)圖解。為了打開(kāi)RNA結(jié)構(gòu)，我們采用單光鑷實(shí)驗(yàn)方案。實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)要求玻片表面修飾只與A球結(jié)合，B為懸浮小球提供光鑷操控。光鑷控制B球通過(guò)1-2與3-4的DNA-RNA雜交手柄牽拉RNA使其結(jié)構(gòu)打開(kāi)。為了達(dá)到此效果，首先采用不同大小的微球以區(qū)分捕獲的目標(biāo)小球，用直徑小的B球進(jìn)行光捕獲與測(cè)量，大球A方便與樣品室固定。

圖9中，A球?yàn)楸砻嫘揎椨械馗咝量贵w的2 μm PS微球，通過(guò)共價(jià)鍵偶聯(lián)的方式連接在玻片的底面上。B球?yàn)楸砻嫘揎椨墟溍褂H和素的1 μm PS微球，為光鑷測(cè)量小球。1-2和3-4 為DNA-RNA雜交手柄，類(lèi)似于雙鏈DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)。待研究的RNA分子位于DNA-RNA雜交手柄2-3之間。雜交手柄的末端1修飾的地高辛與A上的地高辛抗體相連；雜交手柄的末端4修飾有生物素與B球上鏈霉親和素相連。

圖9 光鑷測(cè)量單分子實(shí)驗(yàn)方法和單分子偶聯(lián)技術(shù)

圖9中，A與B球、RNA、DNA以及玻片之間的分子修飾和偶聯(lián)都是唯一，樣品制備中的各個(gè)環(huán)節(jié)的銜接要嚴(yán)格按照設(shè)計(jì)的先后程序進(jìn)行，并且其中每一步的操作需要絕對(duì)的純凈，以保證每個(gè)結(jié)合點(diǎn)是準(zhǔn)確無(wú)誤的，最終將待研究的分子串接在了兩個(gè)微球之間。在這諸多的環(huán)節(jié)和細(xì)節(jié)中有一環(huán)出錯(cuò)，即前功盡棄。生物分子偶聯(lián)屬于純生化技術(shù)，但是，即便是從事生物化學(xué)的，面對(duì)的也是一項(xiàng)新工作。然而，以往的實(shí)驗(yàn)幾乎是物理學(xué)者去完成，所以從時(shí)間和效率上極大地影響了研究的進(jìn)度。

4)實(shí)驗(yàn)方法。生物作為復(fù)雜體系，實(shí)驗(yàn)樣品的一致性較差。特別是活細(xì)胞天然具有多態(tài)性，即使用完全標(biāo)準(zhǔn)的流程制作出來(lái)的樣品也不盡相同。因此生物實(shí)驗(yàn)常常無(wú)法得到和物理實(shí)驗(yàn)一樣規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)樣品。針對(duì)此情況，物理學(xué)需要采用對(duì)照實(shí)驗(yàn)，數(shù)理統(tǒng)計(jì)計(jì)算置信度等方法進(jìn)行研究，以保證實(shí)驗(yàn)的客觀性和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可信度。這也是物理學(xué)家在從事生物物理研究時(shí)需要適應(yīng)的方面。

作為單分子實(shí)驗(yàn)，我們?nèi)绾闻袛喙忤噷?shí)驗(yàn)中測(cè)量的是單個(gè)分子，這是一個(gè)及其重要的問(wèn)題，并且單分子事件的判斷是根據(jù)每個(gè)實(shí)驗(yàn)個(gè)別設(shè)計(jì)的，相互之間并沒(méi)有共性。為此，在單分子研究中必須設(shè)計(jì)專(zhuān)門(mén)判斷單個(gè)分子的預(yù)實(shí)驗(yàn)，將在每一次實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行。還有，光鑷實(shí)驗(yàn)中的樣品室制備是裝備中的重要環(huán)節(jié)，通常樣品室有其基本的結(jié)構(gòu)，但隨著解決不同的科學(xué)問(wèn)題對(duì)樣品室提出特殊的要求。所以樣品室的制作務(wù)必滿足當(dāng)下的實(shí)驗(yàn)方案，這也是光鑷研究單分子區(qū)別與其他實(shí)驗(yàn)非常突出的一個(gè)特點(diǎn)。

5 光鑷儀器應(yīng)用現(xiàn)狀

光鑷技術(shù)從深度和廣度，已具有獨(dú)立內(nèi)涵和外延的新技術(shù)領(lǐng)域[8]。但到目前為止，種種光鑷依舊停留在物理學(xué)技術(shù)的研究和方法學(xué)創(chuàng)新，而沒(méi)有打開(kāi)應(yīng)用市場(chǎng)。幾十年來(lái)國(guó)內(nèi)外僅幾家公司推出有限的產(chǎn)品，市場(chǎng)需求蕭條。其原因有：1)就光鑷技術(shù)而言，“高端不接地氣”，應(yīng)用面受到極大限制，產(chǎn)品的研發(fā)尚未得到重視和支持；2)缺乏基礎(chǔ)教學(xué)普及，影響關(guān)注度和創(chuàng)新；3)生物應(yīng)用涉及交叉合作，人才匱缺和沒(méi)有相適應(yīng)的人才培養(yǎng)制度。

關(guān)于光鑷儀器的研發(fā)，我們?cè)?jīng)在不同階段進(jìn)行過(guò)相應(yīng)的努力。1997年我們承擔(dān)科技部863自動(dòng)化領(lǐng)域微操作機(jī)器人專(zhuān)題 “全光學(xué)生物微操作儀”的研究項(xiàng)目，完成了將鑷子和光刀組合的光學(xué)工具箱。2001年創(chuàng)辦了國(guó)內(nèi)首個(gè)光鑷儀器研發(fā)的專(zhuān)業(yè)公司，研發(fā)了系列“光鑷微操作儀”，滿足國(guó)內(nèi)需求光鑷儀器的老師和科技人員的需要(如圖10所示)。2002年我們承接了中國(guó)科學(xué)院“納米光鑷系統(tǒng)”科研儀器研制，主要是服務(wù)于自己的科研需求。

盡管光鑷技術(shù)尚未獲得廣泛的應(yīng)用，但是人們對(duì)光鑷的信心依舊，特別期盼諾貝爾獎(jiǎng)的光環(huán)能夠帶來(lái)歷史性的發(fā)展機(jī)遇。近年來(lái)，自行建立的光鑷裝備越來(lái)越多，但這種自己搭建的非專(zhuān)業(yè)設(shè)備的穩(wěn)定性和實(shí)際應(yīng)用效果值得考量。

1)光鑷微操作儀?！肮忤囄⒉僮鲀x”為上海中珂光鑷科技有限公司產(chǎn)品，單光鑷，主要針對(duì)液相中微米微粒的研究而設(shè)計(jì)，提供了對(duì)液相細(xì)胞的三維空間的懸浮、提拉、操控等。

圖 10 光鑷微操作儀

“LOT-II光鑷微操作儀”：樣品為液體中的酵母細(xì)胞，血細(xì)胞，微米球；捕獲力0～10 pN；捕獲物鏡60×，NA=0.85。該儀器為“光的力學(xué)效應(yīng)和光力的測(cè)量”大學(xué)物理實(shí)驗(yàn)教學(xué)專(zhuān)用儀器[26]，2004年獲高等學(xué)校物理教學(xué)儀器一等獎(jiǎng)。作為單細(xì)胞的觀測(cè)和操控手段，也非常適合納入細(xì)胞生物學(xué)的常用教學(xué)儀器。該儀器也適合單細(xì)胞操作的科學(xué)研究，以及需要了解和體驗(yàn)光鑷技術(shù)進(jìn)行科研選題的初期階段研究。

“LOT-Ⅲ 光鑷微操作儀”：樣品微米微粒，如細(xì)胞、細(xì)胞器或微米球；捕獲物鏡100×NA=1.25；捕獲力0～100 pN；圖像分辨率<1 μm；電動(dòng)樣品行程精度1 μm，穩(wěn)定性<5%。儀器的特點(diǎn)是主機(jī)穩(wěn)定，光學(xué)通道為層疊結(jié)構(gòu)，可配置熒光激發(fā)光源、激光微束和拉曼光譜源等光源，拓展更多的功能，適應(yīng)科學(xué)研究創(chuàng)新特點(diǎn)。該儀器廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、軟物質(zhì)膠體科學(xué)、物理與材料科學(xué)、微納加工等領(lǐng)域?！癓OT-Ⅲ 光鑷微操作儀”2018年入圍“中國(guó)科學(xué)院自主研發(fā)科學(xué)儀器”產(chǎn)品手冊(cè)。

2)單分子力譜儀。微型光鑷(Mini tweezers)是加州大學(xué)研究人員Smith研發(fā)的[14-15]，是目前單分子研究的主流設(shè)備。雙光鑷光路，60×水浸物鏡，NA=1.2，150 pN, 位置測(cè)量精度 1.5 nm。特點(diǎn)是系統(tǒng)采取恒力模式，直接讀取力或位移，避免了對(duì)光阱剛度的標(biāo)定。通過(guò)軟件控制操縱樣品的運(yùn)動(dòng)方向及速度。荷蘭公司研發(fā)的超分辨單分子動(dòng)力分析儀(熒光光鑷)——C-Trap，是世界上首款將光鑷、共聚焦或STED 超分辨顯微鏡和微流控系統(tǒng)結(jié)合的單分子操控儀器。光阱數(shù)1～4個(gè)，光阱距離分辨小于0.3 nm; 測(cè)量范圍50 μm×50 μm×35 μm(XYZ)；最大逃逸力1000 pN/4.5 μm PS球。C-Trap能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)單分子動(dòng)力學(xué)特性，用于研究細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)機(jī)制。

6 結(jié)束語(yǔ)

光鑷用于生命科學(xué)研究充分體現(xiàn)了光鑷技術(shù)的價(jià)值，但難度也大。雖然物理學(xué)高精尖工具掌握在物理學(xué)家手中，但是該技術(shù)探尋的科學(xué)問(wèn)題和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的生物學(xué)意義只有生物學(xué)家洞悉。其中，特別是一個(gè)需要符合光鑷平臺(tái)研究的樣品(單分子或細(xì)胞)的制備成為銜接兩個(gè)學(xué)科中間的紐帶，但對(duì)雙方都是全新的課題。在合作交流過(guò)程中，諸多困難不僅僅交織于物理與生物不同學(xué)科知識(shí)，還有不同學(xué)科研究的思想方法以及現(xiàn)有的各項(xiàng)考核制度，等等。然而光鑷技術(shù)對(duì)生命科學(xué)的重要意義始終吸引和激勵(lì)著人們的前行，在光鑷對(duì)解讀生命科學(xué)的價(jià)值獨(dú)具魅力的吸引下，該領(lǐng)域由此而成長(zhǎng)了目前為數(shù)不多的一批物理生物學(xué)交叉學(xué)科人才，使得該領(lǐng)域充滿活力和希望。

如今，各科研單位進(jìn)行縱向聯(lián)合與多學(xué)科間的橫向滲透，紛紛成立“交叉研究中心”。我們有幸也納入物理-生物交叉研究中心，并且技術(shù)送上門(mén)，將單分子光鑷建在生命科學(xué)院。實(shí)踐證明這種近距離的安排的確能夠方便地利用到生化資源，以及增加了與生物學(xué)家合作交流的機(jī)會(huì)。

物理學(xué)是一門(mén)理論和實(shí)驗(yàn)高度結(jié)合的精準(zhǔn)而嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)，一切均有理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。而生物學(xué)則是從宏觀的、相適應(yīng)的和運(yùn)動(dòng)的視角，通過(guò)思維導(dǎo)圖的各種符號(hào)、文字和圖形(人為規(guī)定)，將抽象實(shí)物具體化。實(shí)驗(yàn)是統(tǒng)計(jì)的，結(jié)果是推測(cè)的。這種物理和生物學(xué)雙方學(xué)科長(zhǎng)期各自形成的學(xué)科思維方法，需要彼此了解、理解和滲透，鑒于此，一個(gè)穩(wěn)定的物理生物交叉研究平臺(tái)，相適應(yīng)的人才培養(yǎng)政策是發(fā)展交叉學(xué)科的關(guān)鍵。

知識(shí)是科技發(fā)展的原動(dòng)力。單個(gè)光子的能量極其微弱(10-14μJ)，動(dòng)量之小，有史以來(lái)光動(dòng)量幾乎無(wú)人問(wèn)津。直到1960年激光問(wèn)世，光動(dòng)量這一屬性才為科學(xué)界所重視。半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，利用光的力學(xué)效應(yīng)的科學(xué)研究取得矚目的成就。利用光壓原理發(fā)明了激光冷卻和幽禁原子的方法，獲得1997年度諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。這一研究成果促成實(shí)現(xiàn)了“玻色-愛(ài)因斯坦凝聚”，獲得2001年度諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。在此期間A.Ashkin于1986年發(fā)明了光鑷技術(shù)，使光動(dòng)量作用的應(yīng)用擴(kuò)展到微小宏觀領(lǐng)域。從此人們能夠直接觀測(cè)到光動(dòng)量產(chǎn)生的光力作用及其光與物體相互作用的各種力學(xué)效應(yīng)現(xiàn)象。光鑷技術(shù)使光動(dòng)量屬性展現(xiàn)得淋漓盡致，極大發(fā)展了光力學(xué)效應(yīng)的研究和應(yīng)用[8]。光鑷技術(shù)作為一項(xiàng)新技術(shù)經(jīng)過(guò)三十年的發(fā)展已經(jīng)比較成熟，但目前僅少數(shù)高校老師將光鑷技術(shù)相關(guān)的知識(shí)納入到自己的課堂內(nèi)容中。我們希望物理課程能盡快將光力學(xué)效應(yīng)及光鑷原理納入教學(xué)大綱。光鑷操控細(xì)胞的微操作儀器可以成為物理和生物基礎(chǔ)教學(xué)實(shí)驗(yàn)課常用的工具[26-28]。

學(xué)科交叉點(diǎn)往往就是科學(xué)新的生長(zhǎng)點(diǎn)、新的科學(xué)前沿，這里最有可能產(chǎn)生重大的科學(xué)突破，使科學(xué)發(fā)生革命性的變化。光鑷就是如此吸引著我們典型的學(xué)科前沿交叉技術(shù)，并且屬于服務(wù)于其他各類(lèi)學(xué)科的技術(shù)。技術(shù)最終要走向應(yīng)用才有其生命力，展望光鑷技術(shù)的魅力載著諾貝爾獎(jiǎng)的光環(huán)迎接嶄新的未來(lái)。