硬齒獼猴桃組織培養和快速繁殖技術研究

畢海林,吳永斌,楊洪濤,楊燕林,楊正松,和文佳*

(1.云南省農業科學院 高山經濟植物研究所,云南 麗江 674199;2.云南麗江藍瑪生物科技開發有限責任公司,云南 麗江 674199)

硬齒獼猴桃(ActinidiacallosaLindl.),是獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(ActinidiaLindl)一種大型落葉藤本。該種是一個龐雜的大類群,形態多樣,其共同點是近全體無毛,僅部分的脈腋和花序花萼等處被毛。硬齒獼猴桃為原變種,共有6個變種,分別為臺灣獼猴桃、尖葉獼猴桃、毛葉硬齒獼猴桃、京梨獼猴桃、異色獼猴桃、駝齒獼猴桃。硬齒獼猴桃分布于中國長江以南各省區,西起云貴高原和四川內陸,東至臺灣省,云南文山、漾濞、景東、鳳慶、富寧、屏邊等地均有分布,此外,印度、不丹和印度北部地區也有分布[1]。獼猴桃的質地柔軟,口感酸甜，味道被描述為草莓、香蕉、菠蘿三者的混合。獼猴桃除含有獼猴桃堿、蛋白水解酶、單寧果膠和糖類等有機物,以及鈣、鉀、硒、鋅、鍺等微量元素和人體所需的17種氨基酸外,還含有豐富的維生素C、葡萄酸、果糖、檸檬酸、蘋果酸、脂肪。1顆獼猴桃能提供1個人一日維生素C需求量的兩倍多,被譽為“水果之王”。獼猴桃還含有良好的可溶性膳食纖維以及具有出眾抗氧化性能的植物性化學物質SOD。獼猴桃還具有穩定情緒、降膽固醇、幫助消化、預防便秘、止渴利尿和保護心臟等作用。我國是獼猴桃的原產地,有著豐富的獼猴桃遺傳資源[2]。獼猴桃大多是雌雄異株,采用種子繁育,周期長,且較難鑒別幼株性別,不易獲得大批雌株群體;而利用扦插、嫁接的育苗方法,存活率較低。與其他育苗方式相比,組織培養不但能周年供苗,高效快速，而且成本低廉。 1975年Hirsch首次以獼猴桃莖段為材料,進行離體培養,為獼猴桃組織培養的研究工作揭開了序幕；從此,國內外利用組織培養技術快速繁殖獼猴桃受到了廣泛的重視[3-8]。國內外有關獼猴桃栽培品種組織培養的研究報道較多,有關獼猴桃野生種組織培養的研究報道也不少見,而有關硬齒獼猴桃的組培快繁技術尚未見報道。我們對硬齒獼猴桃進行了組織培養、快速繁殖技術的研究,以期為硬齒獼猴桃野生資源的開發和利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

硬齒獼猴桃果實、枝條，取自云南滄怒分水嶺。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒及初代培養 以硬齒獼猴桃的干種子、帶腋芽莖段作為外植體。9月下旬取硬齒獼猴桃的成熟果實和枝條進行處理,干種子為從成熟果實中洗出并晾干的當年種子。將種子、莖段均用洗衣粉液浸泡5 min,用流水沖洗2 h,然后放入超凈臺,用70%乙醇消毒30 s,用無菌水浸洗2次,再用0.1%升汞溶液分別消毒2、8 min,最后用無菌水浸洗5次后供接種使用。將種子、莖段直接接種在以下5種誘導培養基上:MS基本培養基、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA、MS+0.5 mg/L ZT+0.2 mg/L IBA、MS+0.5 mg/L ZT+0.5 mg/L IBA。培養溫度為(25±2)℃,光照強度為3000 lx,光照時間為12 h/d,培養基pH值均為5.8。每瓶培養基接種10粒種子或1個莖段,以60粒種子或60個莖段為1個組合,分別重復3次,觀察記錄種子及莖段的變化情況,對種子培養150 d以后的生長情況、莖段培養45 d以后的生長情況進行統計及分析。

1.2.2 繼代增殖培養 培養基均為MS培養基。 將初代培養萌發的種子苗和腋芽新枝剪成約1 cm的莖段,接種到含不同激素配比的6種增殖培養基上,增殖培養基分別為MS+1.0 mg/L 6-BA、MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA、MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA、MS+2.0 mg/L 6-BA、MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA、MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA。培養條件與初代培養相同,每瓶接4個莖段,培養45 d后測量苗的高度及統計新轉接的培養瓶數,每種配方統計測量6瓶。

1.2.3 生根培養及煉苗移栽 將試管苗剪去基部愈傷組織,并剪成約長2 cm的莖段,接種在以下5種生根培養基上：1/2MS、1/2MS+0.5 mg/L IBA、1/2MS+1.0 mg/L IBA、1/2MS+1.5 mg/L IBA、1/2MS+2.0 mg/L IBA。培養條件與初代培養及繼代培養相同；在培養第45天觀察統計生根情況,每種配方統計測量6瓶。將試管苗進行煉苗,即把培養瓶微開蓋,3 d后將瓶蓋打開1/3左右,再過3 d將瓶蓋去除,2 d之后進行移栽,以草炭土和珍珠巖(10∶1)作為苗床基質,用消毒劑將苗床進行消毒,移栽時盡量剪去葉片；移栽后要注意保持空氣濕度,并遮蔭養護。

將試管苗剪去基部愈傷組織,并剪成約長2 cm的莖段,蘸1000 mg/L IBA后分別扦插在細沙+珍珠巖(20∶1)、草炭土+珍珠巖(20∶1)、椰糠+珍珠巖(20∶1)、松針粉+珍珠巖(20∶1)4種基質中,將基質分別盛放在70孔穴盤中；扦插以后放入大棚里的塑料小拱棚內,觀察生根情況,每種基質觀察3盤,并在第45天統計生根情況;在第75～90天將穴盤苗上營養缽或進行大田移栽。

2 結果與分析

2.1 硬齒獼猴桃外植體初代培養生長情況

由表1和圖1可以看出,硬齒獼猴桃種子在培養基中需要很長時間才能萌發,普遍需要4個月以上才開始萌發,且在5個月后觀察統計時,發現種子萌發率普遍不高,其萌發率在60%～75%。加了激素6-BA、ZT、IBA的培養基與不加激素的培養基相比,無論是種子萌發時間,還是種子萌發率均差異不明顯。在MS基本培養基中,種子萌發后苗長高較快,基部不形成愈傷組織,最后統計時苗最高;而在加了不同濃度的6-BA、IBA、ZT或IBA的培養基上,種子萌發后基部均逐漸膨大形成或多或少的淡綠色致密的愈傷組織,但在形成的愈傷組織上沒有分化出叢生芽,苗長得較慢。由此說明,一定濃度的激素6-BA、ZT、IBA對硬齒獼猴桃種子的萌發無促進作用,不加激素的MS基本培養基是硬齒獼猴桃最佳的種子啟動培養基。

由表1和圖1還可見,硬齒獼猴桃帶腋芽的莖段腋芽萌發較快,在加有一定濃度的激素6-BA、ZT或IBA的培養基中一般培養1周腋芽就開始萌發;在不加激素的培養基中腋芽萌發較緩慢,需要2周多才能萌發。另外,在加有一定濃度的激素6-BA、ZT或IBA的培養基中腋芽的萌發率較高,基本在90%以上,而且腋芽萌發后伸長較多,在45 d統計測量時,伸長的腋芽枝條平均長度普遍超過3 cm;在不加激素的培養基中腋芽萌發較緩慢,且腋芽萌發后伸長極少。另外,對比加有激素的4種培養基發現：當細胞分裂素6-BA、ZT的濃度相同時,較低濃度的生長素IBA更有利于腋芽枝條的生長;而當生長素IBA的濃度相同時,一定濃度的細胞分裂素6-BA、ZT均有利于腋芽枝條的生長,且6-BA和ZT差別不明顯。故MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA可作為硬齒獼猴桃較佳的莖段腋芽的初代培養啟動培養基。

表1 2種硬齒獼猴桃外植體在MS基本培養基上初代培養的生長情況

A,種子開始萌發; B,腋芽生長狀態; C,繼代培養第45天時的增殖狀態;D，培養瓶內生根培養第45天時的生根狀態; E，瓶外生根培養第45天時的生長情況。

2.2 不同激素對硬齒獼猴桃不定芽分化和增殖的影響

由表2可以看出,在培養45 d后,不同濃度的6-BA和IBA對硬齒獼猴桃的增殖影響較顯著。當細胞分裂素6-BA的濃度為1.0 mg/L時,不加生長素IBA的培養基中苗長得也較高,只是苗的基部基本上沒有愈傷組織形成,形成的叢生芽極少,其增殖系數最低,但也達到了4.6;而在加較低濃度生長素IBA的培養基中苗長得最高,苗的基部有較少的愈傷組織形成,但叢生芽分化較少,增殖系數稍高;在加較高濃度生長素IBA的培養基中苗長得較高,苗的基部有較多的愈傷組織形成,叢生芽分化也較多,增殖系數較高。當細胞分裂素6-BA的濃度為2.0 mg/L時,在不加生長素IBA的培養基中苗長得較高,只是苗的基部基本上沒有愈傷組織形成,形成的叢生芽極少,其增殖系數較低;而在加較低濃度生長素IBA的培養基中苗長得稍高一些,苗的基部有較少的愈傷組織形成,叢生芽分化較少,增殖系數也較低;在加較高濃度生長素IBA的培養基中苗長得最矮,但苗的基部有較多的愈傷組織形成,此時叢生芽分化最多,增殖系數最高,達到7.4。由此可見,較高濃度的生長素IBA有利于硬齒獼猴桃愈傷組織的形成,而且較高濃度的細胞分裂素6-BA的協同作用有利于其叢生芽的分化。培養基MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA較有利于硬齒獼猴桃的增殖。

表2 不同激素對硬齒獼猴桃不定芽分化和增殖的影響

2.3 生根培養及煉苗移栽

2.3.1 不同濃度生長素IBA對硬齒獼猴桃培養基內生根的影響 由表3可以看出,無論加不加生長素IBA,所有培養基中苗基部或多或少均形成愈傷組織,根原基形成一般均需1周左右。在不加生長素IBA的培養基中，根基部愈傷組織較小,生根率達到100%;而在加有生長素IBA的培養基中,根基部愈傷組織均較大,且濃度越高,愈傷組織通常越大,極少量的苗只有愈傷組織但不長根,生根率略有降低;在不加生長素IBA或加有較高濃度 IBA的培養基中，苗長得較高,平均根長也較長;隨著IBA濃度的增高,生根數逐漸增多,在加較高濃度IBA的培養基中苗最高,平均根長最長,根數也最多。綜合來看,1/2MS基本培養基是硬齒獼猴桃較佳的生根培養基。

表3 IBA濃度對硬齒獼猴桃培養基內生根的影響

2.3.2 不同基質對硬齒獼猴桃培養瓶外生根的影響 由表4可以看出：當細沙+珍珠巖作為基質時,硬齒獼猴桃的生根率較低,開始生根的時間也較長,生根后苗也長高較少;而在草炭+珍珠巖、椰糠+珍珠巖、松針粉+珍珠巖3種基質中，硬齒獼猴桃長根較快,生根率也較高,生根后苗也長高較多,其中在草炭+珍珠巖、椰糠+珍珠巖基質上生根率稍高,在椰糠+珍珠巖上苗生根后長高最多。綜合來看,椰糠+珍珠巖(20∶1)是硬齒獼猴桃較好的培養瓶外生根基質。

表4 不同基質對硬齒獼猴桃培養瓶外生根的影響

3 討論與結論

在本實驗中,一定濃度的細胞分裂素6-BA、ZT與較低濃度的生長素IBA協同作用有利于硬齒獼猴桃腋芽枝條的萌發及生長;當IBA的濃度相同時,一定濃度的6-BA、ZT均有利于腋芽枝條的生長。因為玉米素ZT是一種價格非常昂貴的激素,而6-BA又比較便宜,因此在今后硬齒獼猴桃初代培養腋芽萌發及生長時,宜選用6-BA而不用ZT,這樣能有效降低硬齒獼猴桃組培苗的生產成本,有利于其下一步產業化發展。

在硬齒獼猴桃培養基內生根誘導時,加了生長素IBA以后,苗基部形成了較大的愈傷組織,這會對今后的煉苗移栽造成一定程度的影響,甚至會降低煉苗移栽的存活率。

另外,培養基內誘導生根和瓶外基質內扦插均能使硬齒獼猴桃高效生根,但兩種方式各有優缺點。在培養基內誘導生根,當試管苗開始生根以后,苗迅速長高,在第45天統計時,苗長高了2～3倍,但整個過程需在超凈工作臺上無菌操作完成,費時費力,且需要進行后期的基質內煉苗移栽。在瓶外基質內扦插,苗長根后生長較緩慢,但整個過程無需超凈工作臺,可以聘請大量工人在短時間內完成扦插,且生根后養護一段時間后可直接上營養缽或進行大田移栽,即將“生根”與“煉苗移栽”同步進行。因此,瓶外基質內扦插更有利于硬齒獼猴桃的工廠化育苗及其產業化開發。

本實驗發現,雖然硬齒獼猴桃在松針粉+珍珠巖上生根率較低,但是松針粉的成本較低,因此在一些松針較豐富的地方,可以選用松針粉+珍珠巖作為硬齒獼猴桃的生根基質。

本實驗結果表明：在初代培養階段,一定濃度的激素6-BA、ZT、IBA對硬齒獼猴桃的種子萌發無促進作用,不加激素的MS基本培養基是硬齒獼猴桃最佳的種子啟動培養基; MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA可作為硬齒獼猴桃較佳的莖段初代培養啟動培養基；在繼代培養階段, MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA較有利于硬齒獼猴桃的增殖；在生根階段,1/2MS基本培養基是硬齒獼猴桃較佳的生根培養基;椰糠+珍珠巖(20∶1)是硬齒獼猴桃較好的培養瓶外生根基質。