多浪羊非繁殖季節同期發情、妊娠及激素水平的觀察與測定

常 璐,牛志剛,王 剛,肉司旦·有力瓦司,艾山·買買提,林嘉鵬,史洪才*

(1.石河子大學 動物科技學院,新疆 石河子 832003;2.新疆畜牧科學院 農業部家畜繁育生物技術重點開放實驗室,新疆 烏魯木齊 830026;3.新疆五征綠色農業發展有限公司,新疆 麥蓋提 844600;4.新疆麥蓋提縣畜牧獸醫站,新疆 麥蓋提 844600;5.新疆麥蓋提縣種羊場,新疆 麥蓋提 844600)

0 前言

綿羊的繁殖力是一個極其復雜的性狀,受遺傳、環境和飼養管理條件等多種因素的影響,其中遺傳是最主要的影響因素,內分泌也起到重要作用。研究者發現骨骼形態發生蛋白受體IB基因(bone morphogenetic protein-IB,FecB)是綿羊多胎的主效基因[1]。在FecB基因外顯子6上發生A746G突變,這個突變造成編碼蛋白質的氨基酸發生了改變,影響了下游控制卵泡發育基因的表達,從而影響母羊卵巢中大量有腔卵泡早熟及排卵數增加[2]。在哺乳動物的發情過程中,控制卵泡的發育是調節動物發情周期的關鍵因素。雌性動物的性周期和生殖活動受下丘腦-垂體-促性腺激素軸的調控。不同繁殖時期的生殖激素分泌水平不同,而生殖激素水平的差異影響動物的繁殖力[3]。

多浪羊是新疆南疆地區的一個優良的肉脂兼用型地方綿羊品種,具有體格大、早熟、產肉率高的特點。多浪羊母羊在四季均可發情,平均產羔率為113%～130%。羔羊在早期生長發育快,周歲時期的單、雙羔羊體重幾乎沒有差異,是典型的適宜農區生產的理想品種。多浪羊群體存在多胎主效基因FecB突變,該突變引起了多浪羊產羔數的增加[4]。近年來,利用同期發情技術能有效提高繁殖率和生產管理水平,使母羊在一定時間內集中發情、集中配種、集中產羔。但關于多浪羊同期發情后相關激素水平的測定暫時未見相關報道。我們在非繁殖季節研究了FecB不同基因型多浪羊,在外源激素同期發情處理的基礎上比較了FecB不同基因型母羊同期發情效果,測定了與綿羊繁殖有緊密關系的E2、P4、LH、FSH的濃度,以期為合理利用FecB基因培育多浪羊高繁殖力品系提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 實驗羊的選擇、管理和分組

于2018年7～9月,在新疆喀什麥蓋提縣多浪羊良種繁育中心挑選健康、膘情中等的多浪羊母羊174只,年齡1～2歲。其中B+型母羊49只,++型母羊125只。種公羊選2歲以上、健康、性欲旺盛、精液質量好的成年公羊;試情羊選用有配種史、性欲旺盛的本地公羊。

1.2 實驗藥品和材料

羊用孕酮海綿栓(CIDR,新西蘭Inter Greaulane公司)、注射用絨促腺素(HCG,寧波市三生藥業有限公司)、孕馬血清促性腺激素(PMSG,寧波市三生藥業有限公司)。生理鹽水、酒精、碘酒、高錳酸鉀粉、青霉素、新潔爾滅、采精內胎和外殼、開膣器、輸精槍、1 mL注射器等均為國產。根據ELISA試劑盒說明書(Abcam,上海)進行檢測。

1.3 同期發情實驗羊的處理

本試驗采用單因素設計,共設2個組,在母羊生殖道內均埋置海綿栓,在放栓期間觀察母羊陰道有無炎癥反應,若有膿性分泌物并伴有黏膜潮紅和出血現象時,則應給予治療。在第11天于臀部肌肉注射孕馬血清330 IU/只；在第13天早上撤栓；在發情12 h后于臀部肌肉注射人絨毛促性腺激素0.1 mg/只。

1.4 母羊發情的鑒定

在早上和傍晚氣溫較低時,將戴有試情布的多浪羊公羊放到母羊圈各試情1次,如果母羊出現搖尾、外陰部腫脹、接受爬跨、分泌黏液則為發情表現；每間隔12 h試情1次,連續試情3 d；在60 h內發情視為同期處理有效,記錄每只羊從撤栓到發情的時間間隔,集中飼養。

1.5 人工授精

采集健康公羊的精液,進行質量檢查。分別在母羊發情后的12 h和24 h，采用開膣器法,于子宮頸口輸入鮮精0.1 mL。

1.6 母羊妊娠的鑒定

在發情母羊人工授精60 d后，用獸用B超直腸檢查進行妊娠診斷，判定是否受孕,統計受胎率。

1.7 血樣采集和激素濃度的測定

挑選發情癥狀明顯的多浪羊母羊89只,其中B+基因型32只,++基因型57只,對每只母羊在撤栓、發情0 h、發情12 h和發情24 h時空腹靜脈采取血樣2 mL,在室溫下靜置4～6 h,以3000 r/min離心15 min,分離上層血清于1.5 mL的離心管中,應用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)測定發情期經產母羊血清中雌二醇(Estradiol, E2)、卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone, FSH)、促黃體素(Luteinizing hormone, LH)和孕酮(Progesterone, P4)的濃度。根據ELISA試劑盒說明書進行檢測。

1.8 數據統計分析

應用SPSS 22.0 (SPSS, Inc, Chicago, IL, USA)對發情率、受胎率數據進行卡方檢驗;應用SPSS 22.0中的重復測量數據分析和單因素ANOVA分析方法對不同FecB基因型綿羊外周血中E2、FSH、LH和P4濃度的測定數據進行差異顯著性評估,結果以平均值表示。

2 結果與分析

2.1 不同FecB基因型母羊在各時間段內同期發情效果

在埋栓過程中,均沒有出現掉栓現象。由表1可知：B+和++型多浪羊組在60 h內的總發情率分別為83.67%和85.60%,差異不顯著；B+型多浪羊的發情時間集中在24～48 h內,期間內的發情率為73.46%；++型多浪羊的發情時間集中在24～36 h,發情率為75.2%。

2.2 多浪羊人工授精受胎率情況

由表2可見,經人工授精后，++型多浪母羊的受胎率為67.29%,B+型母羊的受胎率為65.85%,差異不顯著。

2.3 不同FecB基因型多浪羊血清中FSH、LH、E2和P4濃度的比較

2.3.1 FSH濃度的比較 從表3可以看出:在撤栓、發情0 h、12 h和24 h時,不同FecB基因型多浪羊在4個時間點血清中FSH濃度均表現為B+型高于++型,但差異均不顯著。

表1 不同FecB基因型母羊在各時間段內同期發情效果 %

注:受試B+和++型多浪母羊的總數分別為49和125只。同一列數據后附相同字母表示差異不顯著，附不同小寫字母表示差異顯著(P<0. 05),附不同大寫字母表示差異極顯著(P<0. 01)，下同。

表2 多浪母羊經人工授精后受胎率情況

表3 B+型與++型多浪羊血清中FSH濃度的比較 IU/L

2.3.2 LH濃度的比較 從表4可以看出：各時間點血清中LH濃度均表現為B+型高于++型,但在不同基因型組間均無顯著性差異。

表4 B+型與++型多浪羊血清中LH濃度的比較 ng/L

2.3.3 E2濃度的比較 由表5可知：B+型在觀察期內4個時間點的分泌水平都高于++型,其中在撤栓和發情0 h兩個時間點,B+型血清中E2濃度極顯著高于++型的(P< 0.01)；B+型血清中在4個時間點的平均E2濃度也極顯著高于++型的(P<0.01)。

表5 B+型與++型多浪羊血清中E2濃度的比較 ng/L

2.3.4 P4濃度的比較 由表6可知：在發情0 h、12 h和24 h時，B+型血清中的P4濃度均高于++型的,但差異不顯著；在撤栓時B+型血清中的P4濃度極顯著高于++型的(P<0.01);對4個時間點的平均P4濃度而言,B+型顯著高于++型的(P<0.05)。

表6 B+型與++型多浪羊血清中P4濃度的比較 pmol/L

3 討論

3.1 FecB不同基因型多浪羊同期發情效果比較

綿羊FecB基因實際上為骨骼形態蛋白IB型受體(FecB)基因。研究表明,由于Q249R氨基酸替代使FecB與其配體結合能力降低,導致其功能部分喪失,最終導致綿羊排卵率和產羔數的增加[5]。史洪才等在2011年首次在新疆多浪羊群體中發現了FecB突變并且驗證了其與產羔數的關聯性,發現B+型多浪羊的產羔數均值比++型多0.51只(P<0.01)[4]。本研究選取空懷多浪羊母羊174頭做同期發情處理,其中B+型多浪羊49只,結果顯示：B+和++型多浪羊在60 h內的總發情率分別為83.67%和85.60%,前者略低于后者,但差異不顯著；與++型多浪羊相比,B+型多浪羊的發情時間長。因此對多浪羊進行海綿栓配合激素實施同期發情處理時,建議延長B+型多浪羊的配種時間。此外，++型母羊的受胎率為67.65%,B+型母羊的受胎率為65.85%,說明受胎率不受FecB基因突變的影響。B+型個體作為父、母本往往在育種過程中被選用于擴繁群體,因此在生產實踐中畜牧工作者需要針對B+型個體的特殊情況來制定不同的配種和繁殖策略。

3.2 多浪羊FecB不同基因型同期發情激素濃度的變化

生殖激素與綿羊性器官、性細胞、性行為的發生和發育以及發情、排卵、妊娠、胚胎發育、分娩、泌乳等生殖活動有著密不可分的聯系。FSH和LH是參與并調節卵泡發育和竇狀卵泡排卵的重要激素[6]。2008年高立坤等發現高繁殖力的濟寧青山羊血漿中FSH濃度較高,在全年各月份和4個季節中均高于低繁殖力的沂蒙黑山羊，但差異不顯著[7]。不同FecB基因型母羊的外周血中LH濃度沒有顯著性差異,但BB型母羊的LH脈沖幅度有時較高,而在不同基因型綿羊間LH脈沖頻率相似,因而BB型母羊仍傾向于具有較高的LH水平[8]。本試驗在多浪羊群體中發現,B+型在觀測期任何時間點的FSH和LH濃度都高于++型,但在兩種FecB基因型群體間差異不顯著。FSH和LH是促進卵泡發育和排卵的主要激素,其中LH在卵泡選擇性發育過程中起主要作用,血液中LH基礎濃度的高低與母羊排卵數的多少有關系[9-11]。由于不同的FecB基因型綿羊在排卵數表型上表現差異顯著,推測FecB基因突變后可能會導致FSH和LH激素的大量分泌。后來,研究者們又證明了FecB基因突變并不一直影響FSH和LH的分泌[12-13]。FecB不同基因型多浪羊血清中的FSH和LH濃度均差異不顯著,說明攜帶FecB基因的綿羊可能對FSH和LH激素更為敏感[14-15]。

E2是卵巢分泌的一種類固醇激素,與卵泡發育密切相關。卵子發育對發情時的E2高濃度水平有積極的反饋作用,而E2濃度的下降對配種后促進胚胎著床和維持正常妊娠活動有重要作用。Bartlewski等[16]研究發現高繁殖力Finn羊相比于低繁殖力Finn羊,血清中存在更高的E2濃度,且差異極顯著(P<0.01)。楊華等[17]對FecB不同基因型多胎薩福克羊外周血中生殖激素水平進行測定時發現,發情期多胎薩福克母羊的FecB基因突變使E2水平升高。本試驗結果表明B+型多浪羊群體在觀察期的E2濃度極顯著高于++型群體的,與上述研究結果一致。

P4是由黃體和胎盤產生的類固醇類激素,與E2協同作用促使母畜表現出發情。FecB基因編碼區突變,改變了骨骼形態發生蛋白在綿羊卵巢中的信號傳遞機制,影響其天然配體BMP4和GDF5對孕酮產生抑制的作用,相比于++型,B+型的顆粒細胞對于GDF-5和BMP-4的刺激敏感度較低,導致分泌更高的孕酮水平[18],結果導致顆粒細胞的分化速度加快,進而促進卵泡成熟,排卵數增加[19]。McNatty等[20]發現不同FceB基因型中BB型母羊的血清中P4水平較高。我們選擇的母羊沒有BB型,但B+型P4濃度較高。在山羊卵巢中P4濃度高,更容易產生小卵泡[21-23]。在本試驗中,FecB不同基因型多浪羊血清中P4水平呈顯著差異,推測B+型在發情周期的卵泡發育中起到重要作用,使卵巢可能傾向于產生更多的成熟體積較小的卵泡。

4 結論

在非繁殖季節,對不同FecB基因型多浪羊用CIDR+PMSG+HCG進行同期發情處理,同期發情效果及受胎率不受FecB基因突變的影響。FecB基因突變對不同基因型多浪羊外周血中生殖激素E2、P4的分泌水平有顯著的影響,但不影響FSH、LH的分泌。FecB基因突變研究結果可為合理利用FecB基因培育多胎肉羊提供科學依據。