雞源葡萄球菌攜帶cfr與tet(M)基因于同一質粒的檢測

程于夢,楊夢艷,于潤浩,李德喜

(河南農業大學 牧醫工程學院,河南 鄭州 450046)

葡萄球菌(Staphylococci)是一種化膿性革蘭氏陽性球菌,在自然界中普遍存在,能夠產生外毒素(腸毒素),可能導致家禽出現敗血癥等多種病癥,在豬身上表現為出現滲出性皮炎等癥狀,是引起人類食物中毒和動物細菌感染的重要微生物。近年來,人們治療細菌感染的首選藥物就是抗生素,在抗生素的壓力下,細菌產生了耐藥性,甚至出現了“超級細菌”。2011年,世界衛生組織將“控制抗生素耐藥性”作為世界衛生日的主題,這標志著細菌耐藥性將成為21世紀面臨的最嚴重的問題之一。

利奈唑胺(linezolid)是美國FDA在2000年新批準的惡唑烷酮類藥物,該藥物的作用機制獨特,細菌對其的耐藥比例較低[1-3]。在細菌對利奈唑胺耐藥的機制中,除了核糖體L3、L4和23S rRNA突變外,質粒介導的cfr基因對該類藥物的耐藥也發揮了重要作用[4]。目前cfr基因在葡萄球菌和腸球菌中的流行情況越來越嚴重,因此應該逐步加強對cfr基因的監測與防控。

cfr基因是Schwarz等在2000年從呼吸道感染的小牛鼻腔拭子中分離的松鼠葡萄球菌上首次發現的。通過質粒分析試驗和抗生素敏感性測定，發現該菌株攜帶1個17.1 kb的質粒pSCFS1[5]；該質粒包含1個編碼349個氨基酸序列的開放閱讀框,能夠介導氯霉素和氟苯尼考耐藥,因此將之命名為cfr(Chloramphenieol florlenicol resistance)[6]；cfr基因主要通過基因編碼修飾RNA甲基轉移酶23S rRNA基因第2503位的腺嘌呤殘基引起細菌核糖體甲基化,阻止作用于肽基轉移酶中心的許多抗生素的結合,減少或消除抗生素的功能，實現對藥物產生抗性[7]。

本研究發現了1株耐多藥的葡萄球菌株,該菌株對四環素、酰胺醇類和惡唑烷酮類藥物耐藥。本文主要探究了何種耐藥機制導致該菌株多重耐藥的形成。

1 材料與方法

1.1 工程菌株、實驗藥品和試劑

金黃色葡萄球菌RN4220，由本實驗室保存；氟苯尼考，購自浙江海翔藥業有限公司；利奈唑胺，購自美侖藥業公司；四環素，購自湖北恒碩制藥有限公司；環丙沙星，購自山東金太陽制藥有限公司；慶大霉素，購自江蘇漣水制藥有限公司；氯霉素、紅霉素，購自中國獸醫藥品監察所； Premix Taq酶，購自寶生生物有限公司； DL2000 DNA Marker，購自北京百泰克生物技術有限公司；細菌DNA提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司；質粒中提提取純化試劑盒，購自德國Qiagen公司。

1.2 野生菌株的分離與鑒定

將本實驗室于-80 ℃保存的野生株在顯色培養基瓊脂板上畫線,置于37 ℃恒溫箱培養24 h；用無菌接種環挑取培養長出的白色或粉色單菌落，重新接種于顯色培養基瓊脂板上進行純化增菌培養；從培養基上挑取白色或粉色的葡萄球菌單菌落,接種于2 mL的氯化鈉肉湯中,放置于37 ℃恒溫搖床上，以210 r/min震蕩培養過夜,然后保存菌液，及時進行細菌DNA基因組的制備。

從NCBI Genbank中調出cfr、tet(M)、erm(B)基因序列,采用Primer 5.0軟件設計引物,對野生株STR-9進行16S rRNA細菌種屬鑒定。將引物送至北京六合華大基因科技有限公司進行合成。用于PCR擴增的引物序列見表1。

表1 cfr與tet(M)的PCR擴增引物序列

1.3 藥物敏感性試驗

細菌對藥物的敏感性試驗采用微量肉湯稀釋法,以金黃色葡萄球菌工程菌RN4200為質控菌。藥敏試驗需要的藥物包括氯霉素、氟苯尼考、利奈唑胺、四環素、紅霉素、沃尼妙林、慶大霉素、環丙沙星、鏈霉素、利福平等。藥物敏感性的判定按照美國臨床微生物藥敏試驗判定標準[8]執行。當第12孔陰性對照無菌落生長,而第11孔陽性對照有明顯生長時,讀取該次藥敏試驗結果。

1.4 電轉化試驗

提取野生菌株STR-9的質粒:使用德國Qiagen公司的試劑盒提取質粒DNA；將培養菌液1 mL接種于300 mL BHI肉湯中，于37 ℃恒溫搖床中培養過夜。

制備感受態細胞:將金黃色葡萄球菌RN4200接種于BHI肉湯中,于37 ℃恒溫搖床中培養；在培養2 h后,每隔15～20 min在578 nm波長處測定1次菌液的OD值,當OD值達到0.5～0.6時開始制備感受態細胞[9]；在制備完成后，將RN4220感受態細胞按照100 μL等份分裝于1.5 mL離心管中,保存于-80 ℃冰箱，備用。

電轉化試驗[9]:將轉化后的菌株涂布于含有氟苯尼考(終濃度為10 mg/L)的BHI瓊脂中，于37 ℃恒溫箱中培養24～48 h,觀察電轉子的生長情況。

2 結果與分析

對野生株STR-9進行16S rRNA細菌種屬鑒定,測序結果顯示該野生株為松鼠葡萄球菌。從圖1和圖2擴增結果可以看出在STR-9的基因組中存在cfr與tet(M)[10]耐藥基因。從表2藥敏試驗結果[8]可以看出,標示為野生株的松鼠葡萄球菌STR-9對氯霉素、氟苯尼考、利奈唑胺、四環素、沃尼妙林、慶大霉素和鏈霉素表現耐藥；根據STR-9對利福平、紅霉素表現出高度耐藥的試驗結果，其可能含有相應的erm(B)耐藥基因；對STR-9的基因組進行erm(B)耐藥基因的PCR擴增,試驗結果顯示為陽性。

M, Marker; 1, STR-9。

獲得的電轉子DT-9對氟苯尼考、沃尼妙林、四環素和利奈唑胺等抗生素表現耐藥,對鏈霉素、環丙沙星和利福平表現為敏感,表示未攜帶上述抗生素的耐藥基因。對電轉子DT-9進行cfr、tet(M)與erm(B)基因擴增,cfr、tet(M)結果均為陽性,而erm(B)基因并未檢出,說明cfr、tet(M)耐藥基因位于STR-9的質粒上,而erm(B)基因可能位于該野生株的染色體上,且cfr與tet(M)耐藥基因可以隨質粒的移動進行轉移。測序結果分析發現,cfr和tet(M)基因共存于同一質粒,質粒結構見圖3。

M, Marker; 1, STR-9。

表2 cfr陽性葡萄球菌和電轉子藥敏試驗結果

注: CHL,氯霉素; FFC,氟苯尼考; LZD,利奈唑胺; TET,四環素; ERY,紅霉素; VAL,沃尼妙林; GEN,慶大霉素; CIP,環丙沙星; STR,鏈霉素; RIF,利福平。

圖3 全質粒測序分析結果

3 討論

通過對cfr基因的研究現已證實,cfr基因至少可以導致5類藥物(酰胺醇類、惡唑烷酮類、截短側耳素類、林可胺類、鏈陽菌素A類)耐藥。本研究發現了1株對多種藥物耐藥的葡萄球菌,經PCR檢測發現其含有cfr基因；電轉化試驗及藥敏試驗結果證明,該菌不僅對上述5類化學結構不同的藥物耐藥,并同時含有四環素的耐藥表型,且tet(M)結果為陽性；分析發現其cfr基因和四環素耐藥基因tet(M)共存于同一質粒,在遺傳元件的參與下容易擴散轉移,并且該菌株的質粒通過電轉化試驗可以轉移到金黃色葡萄球菌RN4200感受態細胞中,證明了該質粒的可移動性,這種現象可能是在抗生素的選擇壓力下促成的,因此,我們要加強多藥耐藥基因cfr的監測與防控。

據相關研究報道,cfr基因大多位于質粒上,易于在動物源、環境和人之間進行水平傳播并轉移擴散,cfr基因陸續在多種動物中被發現,如雞、鴨、豬的葡萄球菌,豬、牛等動物的腸球菌[11]。在腸球菌和芽孢桿菌中分離得到了cfr基因[12-15],發現了與cfr基因共存于同一質粒的其他基因,如cfr與erm(A)、cfr與erm(A)基因共存于芽孢桿菌同一質粒中；erm(A)表現出對大環內酯類抗生素耐藥,而且它很可能發生變異,因而會加大治療細菌感染的難度。已有報道證明具有可轉移性的基因cfr和optrA共存于葡萄球菌質粒中[16],如果這種現象擴散到人醫臨床,必將嚴重影響臨床治療的效果。

綜上所述,如何減少cfr耐藥基因在葡萄球菌的出現,從而延長酰胺醇類與惡唑烷酮類抗生素的使用壽命已經成為一個全球關注的熱點問題,同時對其耐藥機制進行深入研究,開發新型抗生素等迫在眉睫。為了減少多重耐藥基因cfr的進一步擴散,我們要加強對該基因的監測與防控。