荒漠草地中氮添加與多環芳烴降解的關系

楊曉東, ,陳 悅,孟凡波,李 巖,,何學敏,,張雪妮,,呂光輝,,,*

1 新疆大學綠洲生態教育部重點實驗室,烏魯木齊 830046 2 新疆大學資源與環境科學學院,烏魯木齊 830046 3 Global Centre for Environmental Remediation (GCER), the University of Newcastle (UON), Newcastle, NSW 2308, Australia 4 新疆大學干旱生態環境研究所,烏魯木齊 830046

多環芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons; PAHs)是含有兩個或兩個以上苯環的芳香族碳氫化合物[1],它是持久性有機污染物的一種,容易在生物體內富集,難以分解[2-3]。環境中多環芳烴除極少部分來源于生物體內合成、火山爆發和森林火災等自然現象外,絕大部分由煤、石油、化工產品和垃圾的不完全燃燒,以及原油在開采、運輸、精煉和使用過程中的泄漏和排污等人類活動所產生[4]。多環芳烴在環境中積累后,可引起人體病變、使農作物減產和品質下降、甚至降低生態系統的穩定性[5]。當前,多環芳烴污染已被認為是世界各國面臨的重大環境與公共健康問題[1,5]。土壤作為重要的多環芳烴匯之一[5],通過它表層的地球化學循環,多環芳烴能從土壤傳遞進入水體、大氣和生態系統,引起二次污染[6]。此外,土壤表層又是植物和農作物營養吸收與根系生長的主要區域,控制土壤特別是耕作層土壤的多環芳烴污染,是消減它進入食物鏈、降低危害和其引起人體健康風險的重要途徑,也是控制整個多環芳烴污染的重要環節[7-8]。

近年來,施肥和化石燃料燃燒等人類活動使大氣氮沉降在全球范圍內不斷增加,陸地生態系統正從人為氮沉降、農業和工業排放中氮中獲得大量可利用氮[9]。大氣氮沉降已成為自然生態系統的一個重要養分資源,并通過凋落物數量和質量、以及微生物群落的改變提高了土壤中植物根系和微生物群落的功能特征,進一步對土壤物理和化學的代謝過程產生影響[9-10]。以往研究證明,土壤中多環芳烴去除主要有土壤腐殖質吸附、根系轉移和微生物分解3種途徑[5-6]。氮沉降量增加后,腐殖質含量、根系和微生物的活性在土壤中都顯著增加[10-11]。此情況下,不難推測：在多環芳烴污染土壤中加入外源氮素,將有助于促進植物根際吸收多環芳烴和提高土壤微生物降解多環芳烴的能力,減小其在土壤中含量。遺憾的是,目前雖有少量室內模擬試驗證明,氮添加在短期內能促進土壤多環芳烴被植物根系吸收和微生物降解的能力[12-13],但它們缺乏自然環境下的驗證。加之,室內人工配置土壤和自然土壤差別較大,土壤又是一個非常復雜的系統。外源氮素加入后是否在自然狀態下提高多環芳烴的降解能力？答案仍舊不明。

目前,利用植物修復方法減少土壤多環芳烴污染的相關研究中,均證明修復植物必須滿足它生長的環境條件,對土壤的肥力、含水量、質地、鹽度、酸堿度、氣候條件和系統的穩定性等都要求較高[9,14]。干旱荒漠區草地的系統穩定性較小,水分匱乏和鹽分含量較高是該系統最顯著特征[15]。相較其他地區或室內修復土壤多環芳烴污染的遴選植物,荒漠系統中草本植物生命力十分脆弱,且容易受到環境干擾的影響[15-16]。因此,當前有關植物修復土壤多環芳烴污染的相關報道中,基本未涉及干旱荒漠植物。相反,干旱區荒漠草地是我國北溫帶分布最廣泛的一種生態系統類型,屬于典型氮素限制系統[17]。當地植物的氮素利用能力十分強大,外源氮素極小幅度增加都能極大地提高植物的生理活性,改變土壤環境和微生物群落結構[17-18]。因此,大氣氮沉降增加之后,極可能有利于當地草本植物群落降解土壤中的多環芳烴。但在當前,有關干旱區荒漠草地降解多環芳烴污染的報道不多。

基于以上,本文在新疆克拉瑪依市獨山子化工園區附近的原生荒漠草地上,通過氮沉降模擬實驗,揭示氮沉降與多環芳烴降解之間的相互關系。本文擬回答以下3個科學問題：在干旱區荒漠草地中,(1) 氮沉降是否利于土壤多環芳烴降解？(2) 氮沉降是否改變了土壤環境因子、土壤酶活性和土壤微生物功能多樣性？(3) 在土壤環境因子、土壤酶活性和土壤微生物功能多樣性這3種因子中,那些因子對土壤多環芳烴降解過程起主要作用？回答以上3個科學問題,對尋求土壤多環芳烴污染的控制方法、豐富全球變化的相關理論、以及在新疆克拉瑪依地區治理土壤多環芳烴污染等,都有著十分重要的理論和技術指導意義。

1 材料和方法

1.1 研究地點

克拉瑪依市(84°44′—86°01′E,44°07′—46°08′N)位于我國西北新疆維吾爾自治區準噶爾盆地的西北邊緣,是我國乃至世界最重要的一個石油化工基地。當地隸屬典型干旱內陸氣候,海拔約400 m,年降雨量108.90 mm,年均潛在蒸發3008.90 mm,最熱(7月)和最冷(1月)的月平均氣溫分別為27.90℃和-15.40℃,土壤類型主要為灰漠土和灰褐土。克拉瑪依市的石油行業發展始于1936年,目前具備煉油、化學和石化行業一整套完整的工業體系,可生產燃油、聚烯烴、橡膠、芳香烴和其他26個大類的600種石油產品[19]。

1.2 實驗設計和采樣

在克拉瑪依市獨山子區石化工廠密集排煙位置下風向3 km處的原生干旱荒漠草地內(84°19′7.47″—84°55′2.99″E, 44°49′2.40″—44°19′11.68″N),在2016年4月隨機選擇一個內部較平整的50 m×30 m樣地,隨后,在其內隨機設置3 m×3 m小樣方12個,并隨機分成CK、N1、N2、N3共4組,每組3個小樣方。為避免施氮處理中樣方的相互干擾,以及其他物種對實驗的影響。小樣方周邊20 m內未有喬灌木生長,并在小樣方間設置緩沖帶,間隔距離≥2 m。12個樣方確定后,四周用木樁固定打腳,并用編織繩圈起標記。

中國北方溫帶草原上每年總氮沉降量約為10—30 kg hm-2a-1[9,20]。基于此數值,本文設置了4種模擬氮沉降的實驗梯度：低(N1；10 kg hm-2a-1)、中(N2；30 kg hm-2a-1),高(N3；90 kg hm-2a-1)和未施肥(對照樣地；CK；0 kg hm-2a-1)。每一種施氮處理都設置3次重復。施肥時間從2016年5月(植物生長初期)持續到9月(植物生長末期)。施加氮肥為NH4NO3,施肥時將相應NH4NO3量溶解到18 L水中,用噴霧器施加到土壤。CK樣地施加未含有NH4NO3的18 L水。本文中在5—9月施加水量約等于當地增加了2 mm的年均降水。

本文共收集了兩次土壤樣品：4月(施氮前)和9月(施氮后)的土壤。施氮前土壤在2016年4月初采集,即：在荒漠草地系統植物非生長季采集土壤,此時植物對土壤中多環芳烴、生物非生物環境因子的影響較小。施氮后土壤在2016年9月中旬采集,此時是草本植物生長季節的末期,植物對多環芳烴、生物非生物環境因子的累積效應處于最大值。具體采樣時,4月土壤中NH4NO3尚未添加,它其中所含多環芳烴量相當于背景值。在每一種施肥處理的每一小樣方內隨機設置1個點,采集一個土壤樣本,共計12個。對9月土壤,在每一種施肥處理的每一小樣方內,隨機選擇3個點,采集土樣隨后混合成1個樣品,每種處理各有3個混合土壤,共計12個。土樣樣品采集深度為0—15 cm。土壤樣品采集后分成兩部分：一部分置入密封袋后儲存在-18℃冰箱中,直到測量多環芳烴和土壤微生物功能多樣性；另一部分放置在密封袋常溫保存,用以測量其他環境因素和土壤酶活性。

1.3 多環芳烴含量的測定

依據美國環境保護署(United States Environmental Protection Agency; USEPA) 對多環芳烴的分類,本文檢測了16種優先控制多環芳烴有機污染物,包括萘naphthalene (Nap),苊烯acenaphthylene (Acy),苊acenaphthene (Ace),芴fluorene (Flu),菲phenanthrene (Phe),蒽anthracene (Ant),熒蒽fluoranthene (Fla),芘pyrene (Pyr),苯并[a]蒽benzo(a)anthracene (BaA),屈chrysene (Chr),苯并[b]熒蒽benzo(b)fluoranthene (BbF),苯并[k]熒蒽benzo(k)fluoranthene (BkF),苯并[a]芘benzo(a)pyrene (BaP),茚并[1,2,3-cd]芘indeno(1,2,3-cd)pyrene (InP),苯并[g,h,i]苝benzo(g,h,i)perylene (BgP)和二苯并[a,h]蒽dibenz(a,h)anthracene (DaC)。本文采用Agilent 公司開發的分散固相萃取技術(QuEChERS)提取和凈化土壤樣品中的多環芳烴[21]。該方法使用了兩種快速檢測試劑盒QuEChERS Extraction Kit (5982-5755CH) 和QuEChERS Dispersive Solid Phase Extraction (dSPE) Kit (5982-5158)。提取質量控制包括空白樣品,重復樣及加標回收率。多環芳烴含量測定采用氣相色譜-質譜分析法(Gas Chromatography-Mass Spectrometry; GC-MS)[21]。具體步驟如下：

(1) 土壤樣品前處理：從樣地采集回來的土壤樣品經風干(室溫下2 d),撿除石子、植物根莖等雜質。混合均勻,過10目篩(2 mm),裝入棕色密閉玻璃樣品瓶,置于-20℃冰箱避光中保存。待測定時,將樣品進一步研磨,并過100目篩。

(2) 樣品的提取與凈化(QuEChERS)：準確稱取5.00 g土壤樣品于50 mL離心管中。加入2.00 mL KOH飽和的甲醇溶液,渦旋均勻,靜置10 min。加入5.00 g無水Na2SO4和8.00 mL 1∶1配置的丙酮-正己烷試劑(Extraction Kit 5982-5755CH),渦旋混勻。超聲波提取10 min (30℃)。3500 r/min下離心3 min。取上清液2.00 mL,加入到已提前放入0.20 g的無水MgSO4、0.50 g的硅膠和0.20 g正丙基乙二胺 (PSA) 的離心管中(Dispersive Solid Phase Extraction Kit 5982-5158)。渦旋2 min。最后將樣品離心管在3500 r/min轉速下離心3 min。取上清液儲存在2.00 mL自動進樣器的棕色樣品瓶中 (PTFE襯底蓋),置于-20℃冰箱中保存待測。

(3) 樣品檢測：多環芳烴的檢測采用氣相色譜-質譜分析法 (Gas Chromatography-Mass Spectrometry; GC-MS)[21]。具體檢測過程中,氣相色譜條件控制為：高純氦氣載氣、1.00 mL/min柱流速、290℃進樣口溫度、80℃保持2 min,以12℃/min的速率升溫至200℃,保持0 min,以4℃/min的速率升溫至280℃,保持0 min,再以10·min-1的速率升溫至290℃,保持7 min的柱溫程序、1.00 μL不分流的進樣量；質譜條件控制為：230℃離子源溫度、150℃四級桿溫度；280℃色譜-質譜接口溫度、EI離子化方式和70 eV電離能量。數據采集模式為離子監測。檢測過程中,多環芳烴根據保留時間和質量與電荷的比值(質荷比；m/z)進行分類。16種多環芳烴的濃度采用外標法讀取。16種多環芳烴具體測定條件及待測物保留時間參見Zhao和Zhai[21]。

(4) 質量控制：外標法標準曲線使用多環芳烴標準品SS EPA 610 PAH Mix(4S8743,Sigma-Aldrich,America)。原始標樣采用正己烷稀釋,濃度跨越2個數量級,包括8個標準點。標準曲線的決定系數為0.98—1.00。16種多環芳烴的檢出限范圍在0.70—1.90 μg/kg。QuEChERS提取土壤樣品中多環芳烴的效果采用加標回收率評價。實驗選用艾比湖濕地自然保護區土壤為投加PAHs的載體,設置空白(CK)及高(H)、低(L)PAHs濃度兩組,每組各3個重復。土壤樣品加標處理后,經老化處理24 h再用于提取。高、低濃度下,16種多環芳烴的加標回收率范圍在64.2%—91.7%。平行樣的相對標準偏差(RSD)小于7.00%。空白實驗過程中均未觀測到多環芳烴。

1.4 生物非生物環境因子的測定

土壤酶活性被認為是一種有效評價土壤功能的參數。研究表明,脫氫酶、過氧化氫酶和脲酶分別緊密聯系的土壤中微生物的代謝活動、土壤中環境脅迫和土壤中氮循環動態,因而在以往研究中這三種酶的活性通常用來評估和監測土壤多環芳烴污染的修復[23]。本文中,脫氫酶、過氧化氫酶和脲酶的活性分別采用TTC-TPF比色法、KMnO4滴定法和靛酚藍比色法進行測定[22]。

在土壤微生物功能多樣性分析實驗之前,為防止溫度快速升高造成的細胞熱休克和分解。冰箱-18℃冷凍土壤樣本解凍3天,解凍時溫度逐日增加(第一天為-10℃,第2天為-5℃,第3天為4℃)。待解凍土壤樣品過100目篩后,使用Biolog-ECO生態板(Biolog Inc. Hayward, CA, USA)方法測量土壤微生物的功能多樣性。Biolog-ECO生態板包含31種不同的碳源,每種碳源在每塊平板上重復3次。Biolog-ECO生態板接種液的制備采用Classen等人的方法[24]。土壤樣品接種至生態板后,在30℃恒溫箱中培養,隨后,分別在培養的1、2、3、4、5、6、7天和8天,采用Benchmark Plus微孔板讀數器(Bio-Rad, Hercules, USA)測定吸光值,測定波長為590 nm。從Biolog-ECO生態板上獲得吸光度值,利用公式1—4計算平均顏色變化率(Averages of well color development; AWCD)、Shannon-Wiener 指數和McIntosh均勻度指數。式中,Ci為各反應孔在590 nm下的光密度值,R為對照孔A1的光密度值。待AWCD值計算結束之后,本文利用董立國等的方法[25],篩選144 h(微生物群落活性的穩定點)為土壤微生物功能多樣性最穩定的培養時間。后續分析中所利用的微生物功能多樣性均為培養144 h時的數值。具體篩選過程見圖1。

AWCD=[∑(Ci-R)]/31

(1)

Pi=(Ci-R)/∑(Ci-R)

(2)

H=-∑(Pi×lnPi)

(3)

(4)

圖1 施氮梯度上土壤微生物群落平均顏色變化率隨培養時間的變化Fig.1 Variances in averages of well color development (AWCD) of four treatments of nitrogen fertilization along the incubation time 施氮共4個處理：CK,N1,N2 和N3。它們施氮量分別為0,10,30 kg N hm-2 a-1和 90 kg N hm-2 a-1;數據為Mean±SE

1.5 數據分析

在測得16種優先控制多環芳烴含量的基礎上,依據多環芳烴結構,按分子量將多環芳烴分為低分子量(Low molecular weight PAHs; LMW PAHs)(i.e., 2-and 3-ring PAHs)和高分子量(Heavy molecular weight PAHs; HMW PAHs)(i.e., 4-, 5-, and 6-ring PAHs)共二類多環芳烴[3-4]。前人研究證明,LMW PAHs主要是自然界地質學過程中產生的碳氫化合物(Petrogenic source：原油、燒料油以及精煉油)；相反,HMW PAHs主要是化石燃料熱解以及炭基材料不完全燃燒的產物(Pyrogenic source)[4,26]。因此,LMW/HMW可以用來評估多環芳烴的可能來源。即：LMW/HMW>1.00表明環境中多環芳烴主要來自石油污染物,而LMW/HMW<1.00表示土壤中多環芳烴主要是碳氫化合物熱解或炭基材料不完全燃燒的產物[4,26]。除此之外,多環芳烴異構體的比值,比如Fla/(Fla+Pyr)也被廣泛用于區分環境中多環芳烴的來源[26]。即：Fla/(Fla+Pyr)<0.40,環境中PAHs主要來源于典型石油污染物；0.400.50,環境中PAHs主要來源于傳統生物物質(比如草、木材和煤炭)的燃燒產物[3,26]。本文中,為分析克拉瑪依市干旱荒漠草地內土壤多環芳烴的來源,利用16種優先控制多環芳烴的含量,計算了LMW/HMW和Fla/(Fla+Pyr)的數值。

對照樣地CK在本文中未添加氮素,因而,多環芳烴和生物非生物環境因子在施氮實驗處理前后的差異,可以揭示在植物生長季內(4—9月),當地多環芳烴年沉降量、以及荒漠草本植物對16種多環芳烴降解和生物非生物環境因子的影響。在此情況下,本文中利用獨立樣本t檢驗 (Independent samplet-test) 分析了對照樣地中16種多環芳烴、多環芳烴總量和生物非生物環境因子在4月(施氮前)和9月(施氮后)的差別。t檢驗過程中,施氮前后數據的方差齊性采用Levene F方法用F統計量進行檢驗。方差齊性采用自由度為n1+n2-2的t檢驗(n1和n2分別為施氮前后數據的采集個數),相反,方差不齊性采用修正自由度的t檢驗。此外,利用單因素方差分析(One-way ANOVA)分析多環芳烴和生物非生物環境因子在施氮梯度上的變化。方差分析中,不同處理間(i.e., CK, N1, N2和N3)方差齊性采用Tukey HSD進行檢驗；相反,方差不齊性采用Tamhane′s T3 檢驗。多環芳烴與生物非生物環境因子之間的關系采用廣義線性混合效應模型 (Generalized linear mixed model; GLMM)進行檢驗。模型回歸中,為消除施肥施加梯度造成的隨機影響,將施氮量作為隨機變量,將生物非生物環境因子作為固定變量。所有數據分析過程均在R 3.1.1中完成[27],所有圖均在Origin 8.0中完成。GLMM 使用“lme4”程序包[28]。所有統計檢驗的顯著性P<0.05。

2 結果分析

2.1 克拉瑪依市荒漠草地上多環芳烴來源分析及沉降量估算

對照樣地在施氮前后,LMW/HMW的數值均>1.00；Fla/(Fla+Pyr)的數值在0.40—0.50之間(表1)。這說明克拉瑪依市荒漠草地土壤中的多環芳烴主要來源為原油及其精煉的石油產品。施氮后對照樣地土壤中多環芳烴總量(∑PAHs)和14種多環芳烴的含量均顯著高于施氮前(P<0.05)(表1)。兩種多環芳烴(Acy和Ace)在本文中均未檢測到其數值。

在對照樣地,施氮后的電導率、有機質、總氮、脫氫酶、過氧化氫酶、McIntosh均勻度指數、平均顏色變化率AWCD和Shannon-Wiener指數顯著高于施氮前(P<0.05)；相反,脲酶、銨態氮、硝態氮和速效磷在施氮前顯著高于施氮后(P<0.05)；土壤含水量和pH在施氮前后未有顯著差別(P>0.05)(表1)。

表1 4月和9月對照樣地中多環芳烴含量及生物非生物環境因子的比較

Table 1 Differences in polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), and biotic and abiotic factors between prior and later nitrogen fertilization in an unfertilized control plots (CK)

類型Types名稱Names4月 April9 月 SeptemberMean±SE最大值Maximum最小值MaximumMean±SE最大值Maximum最小值MaximumFTP多環芳烴萘Nap0.28±0.09B0.510.174.31±2.25A7.222.83197.48-10.26<0.01PAHs (mg/kg)芴Flu0.04±0.01B0.050.030.56±0.02A0.580.5516.01-125.37<0.01菲Phe0.12±0.16B0.940.062.12±0.26A2.29 1.822.61-19.62<0.01蒽Ant0.09±0.02B0.140.0613.38±0.21A13.5713.1557.27-370.39<0.01熒蒽Fla0.02±0.01B0.050.010.43±0.04A0.470.4019.70-45.98<0.01芘Pyr0.03±0.01B0.050.011.11±0.16A1.30 0.99120.69-41.19<0.01苯并[a]蒽BaA0.02±0.01B0.040.010.21±0.02A0.23 0.195.34-38.19<0.01屈Chr0.02±0.01B0.040.010.18±0.01A0.19 0.170.03-3.06<0.01苯并[b]熒蒽BbF0.05±0.01B0.070.033.23±0.33A3.572.9054.00-61.57<0.01苯并[k]熒蒽BkF0.12±0.05B0.190.021.98±0.83A2.861.1957.73-13.46<0.01苯并[a]芘BaP0.02±0.01B0.060.020.25±0.09A0.360.20123.01-15.90<0.01茚并[1,2,3-cd]芘InP0.03±0.01B0.050.020.37±0.00A0.380.371.27-107.07<0.01二苯并[a,h]蒽DaC0.04±0.03B0.190.030.29±0.01A0.30 0.280.01-14.95<0.01苯并[g,h,i]苝BgP0.04±0.01B0.070.030.48±0.02A0.51 0.477.23-83.31<0.01多環芳烴總量∑PAHs0.88±0.22B1.730.6328.91±2.32A31.4927.0080.51-73.77<0.01多環芳烴來源Source assignment of PAHs低分子量多環芳羥/高分子量多環芳烴 Low mo-lecular weight PAHs (LOW)/Heavy molecular weight PAHs (HMW)1.41±0.451.42±0.51Fla/(Fla+Pyr)0.40±0.080.38±0.09環境因子土壤含水量/%12.53±2.53A17.329.0510.40±0.05A10.4410.3418.372.030.05Environmental factorspH8.25±0.11A8.418.048.24±0.05A8.328.204.190.310.75電導率EC/(mS/cm)4.52±0.43B5.354.065.71±0.47A6.38 5.127.2717.68<0.01有機質/(g/kg)8.64±2.91B14.455.1612.89±1.25A14.8711.027.31-3.47<0.01速效磷/(mg/kg)20.75±5.04A29.4410.2217.57±1.61B20.81 16.547.611.52<0.05總氮/(g/kg)23.19±3.28B29.6218.4028.05±1.86A30.8725.592.88-3.40<0.01銨態氮/(mg/kg)36.74±11.97A63.6214.6724.52±1.91B26.54 21.237.992.46<0.05硝態氮/(mg/kg)3.91±1.34A7.561.532.94±0.78B4.002.130.941.70<0.05土壤酶活性脫氫酶/(mg/L)0.22±0.09B0.460.084.62±1.07A5.94 3.2964.17-22.62<0.01Soil enzymic activites過氧化氫酶/(mg/L)0.28±0.10B0.600.120.50±0.06A0.590.411.62-5.01<0.01脲酶/(mg/L)2.28±0.44A2.891.261.53±0.18B1.751.264.514.09<0.01土壤微生物多樣性平均顏色變化率AWCD7.90±2.30B13.963.4514.67±2.15A16.9210.390.16-11.16<0.01Soil microbial Shannon-Wiener 指數2.27±0.27B2.921.332.75±0.11A2.89 2.556.48-6.81<0.01functional diversityMcIntosh均勻度指數1.42±0.92B4.930.543.29±0.72A4.36 2.100.02-7.48<0.01

同行Mean±SE 后不同大寫字母表示施氮前后對照樣地上相應數值有顯著性差別,相反,相同大寫字母表示未有顯著性差別;F,TandP為獨立樣本T 檢驗的結果;Low molecular weight (LMW) PAHs為4環以內多環芳烴,heavy molecular weight (HMW) PAHs為4環以上多環芳烴;Nap, Flu, Phe, Ant, Fla, Pyr, BaA, Chr, BbF, BkF, BaP, InP, DaC和BgP 分別是萘Naphthalene, 芴Fluorene, 菲Phenanthrene, 蒽Anthracene, 熒蒽Fluoranthene, 芘Pyrene, 苯并[a]蒽Benzo[a]anthracene, 屈Chrysene, 苯并[b]熒蒽Benzo[b]fluoranthene, 苯并[k]熒蒽Benzo[k]fluoranthene, 苯并[a]芘Benzo[a]pyrene, 茚并[1,2,3-cd]芘Indeno[1,2,3-cd]pyrene, 二苯并[a,h]蒽Dibenzo[a,h]anthracene和苯并[g,h,i]苝Benzo[g,h,i]perylene的縮寫;Acy和Ace分別是苊烯Acenaphthylene和苊Acenaphthene的縮寫,由于這兩種多環芳烴實驗中未檢測到,故在表中不做展示

2.2 施氮梯度上多環芳烴的變化

在克拉瑪依市荒漠草地上,多環芳烴總量(∑PAHs) 隨施氮量增加顯著性減小(N2≤N3

圖2 施氮梯度上多環芳烴總量和不同類型多環芳烴含量的差別Fig.2 Variations in total amount of polycyclic aromatic hydrocarbons (∑PAHs) and different types of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) among the amount of nitrogen fertilizations施氮共4個處理：CK,N1,N2 和N3。它們施氮量分別為0,10,30 kg N hm-2 a-1和 90 kg N hm-2 a-1。Acenaphthylene(Acy)和Acenaphthene(Ace)兩種多環芳烴實驗中未檢測到,故未在圖中展示。不同大寫字母表示施氮梯度上相應∑PAHs有顯著性差別,相反,相同大寫字母表示未有顯著性差別。 F和P 為單因素方差分析的結果。數據為Mean±SE

2.3 施氮梯度上生物非生物環境因子的變化

pH、銨態氮、脫氫酶、土壤微生物群落平均顏色變化率(AWCD)、Shannon-Wiener 指數和McIntosh均勻度指數隨施氮量增加,其值顯著增加(N3≥N2≥N1≥CK)(P<0.05)(表2)。相反,土壤含水量、有機質、速效磷、總氮和脲酶活性在施氮梯度上,隨施氮量增加顯著降低(P<0.05),表現為在N2值最低,N3次之,N1和CK最高(N2≤N30.05)(表2)。

2.4 廣義線性混合效應模型中多環芳烴與生物非生物因子之間的關系

廣義線性混合效應模型的回歸結果中,∑PAHs 和pH、有機質、速效磷、總氮、銨態氮、硝態氮、過氧化氫酶和脲酶的活性、McIntosh均勻度指數之間有顯著的回歸關系(R2=0.98, AIC=246.00,P<0.05)(表3和表4)。相反,16種多環芳烴與生物非生物環境因子之間的關系較為復雜,沒有一致的回歸關系。具體概括如下：銨態氮、硝態氮、有機質、總氮、有效磷和脲酶是影響上述幾種類型多環芳烴含量變化的最主要因素,其分別能解釋上述16種多環芳烴中11種(Phe, Ant, Fla, Pyr, BaA, Chr, BbF, BkF, BaP, DaC, BgP),10種(Nap, Ant, Fla, BaA, Chr, BbF, BkF, BaP, DaC, BgP),12種 (Nap, Flu, Ant, Fla, Pyr, BaA, Chr, BkF, BaP, InP, DaC, BgP),9種 (Nap, Flu, Phe, Ant, Fla, BbF, BkF, BaP, DaC),9 種(Nap, Flu, Fla, Pyr, BaA, BbF, BaP, InP, DaC)和 9種 (Phe, Ant, Fla, Pyr, BaA, Chr, BaP, DaC, BgP)(P<0.05)(表3和表4)。土壤含水量、pH、電導率、平均顏色變化率(AWCD)、香濃-維納豐富度指數(H)、過氧化氫酶、脫氫酶和McIntosh均勻度指數(U)解釋個數最少,約5—7種(表3和表4)。

3 討論

3.1 克拉瑪依市荒漠草地土壤中多環芳烴的儲量及來源

克拉瑪依市作為我國重要的石油石化基地和新型工業化城市,它是世界石油石化產業的一個聚集區,具有油氣資源勘探開發、石油工程技術服務、油氣集輸和煉油化工為一體的完整的石化工業體系。近年,隨國家石油戰略儲備庫、稠油加工及配套項目和千萬噸煉油擴建項目的投產,克拉瑪依目前是北半球儲存石油量最多,生產石油產品最為豐富的一個地區。本文中我們發現,克拉瑪依荒漠草地土壤中的多環芳烴主要來源為原油及其精煉的石油產品,主要以石油及其精煉產品在運輸、裝卸和生產過程中泄漏和排放的碳氫化合物化合物為主,屬于石油污染。這一結果與當地是石油石化基地的工業屬性完全符合,也與張俊葉等對新疆的研究結果一致[29]。

表2 施氮梯度上生物和非生物環境因子的變化

同行Mean±SE后不同大寫字母表示施氮梯度上相應數值有顯著性差別,相反,相同大寫字母表示未有顯著性差別;F和P-values 為單因素方差分析的結果

本文中,對照樣地中未添加氮肥,多環芳烴含量變化可間接表征植物生長季節內(5—9月)多環芳烴在土壤的沉降量。本文結果顯示,∑PAHs、LMW PAHs和HMW PAHs的含量在9月份分別為(28.91±2.32)、(21.90±2.38) mg/kg和(8.67±0.66) mg/kg。目前國內對土壤中多環芳烴污染未有分級標準,國際上通行的標準通常只以∑PAHs為計算依據,對不同環數和分子量均沒有定義[7,30-31]。基于此,本文采用Maliszewska-Kordybach建議的分級標準[7],評價了克拉瑪依市荒漠草地中多環芳烴的污染水平。該評價方法將土壤中多環芳烴的污染劃分為以下4類：∑PAHs<200.00g/kg,無污染土壤；200.00<∑PAHs<600.00g/kg,輕微污染土壤；600.00<∑PAHs<1000.00g/kg,污染土壤；∑PAHs>1000.00g/kg,重污染土壤。克拉瑪依市荒漠草地土壤中9月份∑PAHs>1000.00g/kg,屬于多環芳烴重污染土壤。相比國內的長江三角洲地區農田、閩江沿岸土壤、山東省農田和北京綠地土壤等[8,32-35],本文得出∑PAHs 量較高,但該值也在張俊葉等人調查的全國∑PAHs范圍內[29]。此外,在9月份,對照樣地土壤中的∑PAHs、LMW PAHs和HMW PAHs的含量均顯著高于施氮前。相較4月份,它們值分別增加了32、42和23倍,日均沉降量[(Y2-Y2)/((9-4)月30天); Y2和Y1分別為9月和4月的測定值]分別為0.19、0.06 mg kg-1d-1和0.04 mg kg-1d-1。這些數值相較其他地區,克拉瑪依市的多環芳烴沉降量較高[30-31,35]。但在另一方面,4和9月之間差異較大,也可能與植物根系分泌物的解析作用有關[5,36]。多環芳烴的疏水和親脂的特性讓其結合在土壤顆粒的表面,運用方法提取和檢測時很難將土壤中全部多環芳烴解析出來。本文采用QuEChERS方法,屬于多環芳烴的提取方法中效果偏低的一種。它測定的值往往低于土壤多環芳烴的實際值。植物根際效應通過有機物置換和生物酶的催化作用,一定程度上能將土壤中顆粒表面緊密吸附的多環芳烴激活,讓其溶解在土壤中。因此,在9月份測定的多環芳烴除原土壤溶解能夠被提取多環芳烴外,還包括植物根系效應重新解析出來的部分。相反,在4月份,土壤中測定值僅是土壤中溶解的多環芳烴,其值遠遠小于9月份的土壤。在這種情況下,9月測試得到多環芳烴值遠遠高于4月。這一過程也可以通過對照樣地中生物非生物環境因子在施氮前后的變化進行佐證。本文中,對照樣地的生物非生物環境因子在施氮前后均存在顯著性差別(P>0.05)。這表明植物根系作用可以改變土壤環境,可能影響多環芳烴的解析量。

表3 廣義線性混合效應模型中多環芳烴與生物非生物環境因子的回歸參數

GLMMs中,生物非生物環境因子為固定效應,施氮量為隨機效應。AIC：赤池信息量Akaike information criterion,R2和P-value 均為GLMMs的回歸參數。Acy：苊烯Acenaphthylene和Ace：苊Acenaphthene兩種多環芳烴實驗中未檢測到

表4 廣義線性混合效應模型中多環芳烴與生物非生物環境因子的回歸估計值

Table 4 Estimated Parameters of generalized liner mixed models(GLMMs)for variability of polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs)induced by the biotic and abiotic factors

Polycyclic aromatic hydrocarbons/(mg/kg)GLMMs 中固定效應因子的參數估計值Estimated Parameters of fixed factor in GLMMs截距和它的標準誤Intercept and it′ standard error (SE)截距SE環境因子 Environmental factors土壤酶活性 Soil enzymic activites土壤微生物多樣性 Soil microbial functional diversity土壤含水量/%pH電導率EC/(mS/cm)有機質/(g/kg)速效磷/(mg/kg)總氮/(g/kg)銨態氮/(mg/kg)硝態氮/(mg/kg)脫氫酶/(mg/L)過氧化氫酶/(mg/L)脲酶/(mg/L)平均顏色變化率AWCDShannon-wiener 指數McIntosh均勻度指數biSEbiSEbiSEbiSEbiSEbiSEbiSEbiSEbiSEbiSEbiSEbiSEbiSEBiSE萘Nap-23.7737.1911.593.36-10.922.710.040.35-0.160.090.100.04-0.110.070.010.060.860.170.180.09-5.842.460.360.97-0.030.07-1.780.990.330.12芴Flu1.413.230.370.26-0.590.23-0.030.030.010.00-0.010.000.020.010.000.000.020.01-0.040.00-0.060.220.130.06-0.010.01-0.070.110.000.01菲Phe-10.3611.522.261.04-1.590.850.090.11-0.010.03-0.020.01-0.040.020.030.020.010.050.020.03-0.870.771.290.290.010.02-0.170.31-0.060.03蒽Ant-46.2415.793.641.411.341.110.610.140.390.03-0.020.02-0.220.070.090.03-0.220.07-0.080.04-2.111.00-1.780.41-0.030.031.110.400.040.05熒蒽Fla2.240.86-0.110.08-0.090.06-0.010.00-0.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.020.06-0.030.020.000.00-0.060.020.000.00芘Pyr10.145.21-1.140.470.050.370.030.05-0.030.010.010.000.010.010.050.01-0.010.02-0.020.01-0.210.340.270.130.000.01-0.270.130.020.02苯并[a]蒽BaA-1.190.670.020.060.100.050.030.010.010.000.000.00-0.000.000.010.00-0.020.00-0.000.00-0.0010.04-0.070.020.000.00-0.030.020.010.00屈Chr-0.010.46-0.080.040.090.030.030.000.010.00-0.000.00-0.000.000.000.00-0.010.00-0.000.0010.010.03-0.030.010.000.00-0.010.010.000.00苯并[b]熒蒽BbF-5.874.77-0.740.431.550.34-0.050.040.000.01-0.010.010.040.010.010.01-0.130.02-0.030.011.270.310.040.13-0.010.010.320.12-0.030.02苯并[k]熒蒽BkF-44.8510.843.270.980.90078-0.220.10-0.050.03-0.000.010.090.020.080.02-0.100.050.010.032.510.71-0.350.28-0.020.020.430.280.020.04苯并[a]芘BaP-8.811.990.640.160.220.140.070.020.030.00-0.000.00-0.010.000.010.00-0.020.01-0.000.00-0.360.130.080.040020.000.080.07-0.020.01茚并[1,2,3-cd]芘InP0.290.420.020.03-0.030.030.000.000.000.00-0.000.000.000.000.000.00-0.000.00-0.010.010.100.03-0.010.010.000.000.000.010.010.00二苯并[a,h]蒽DaC0520.230.050.02-0.070.02-0.000.000.000.000.000.00-0.000.000.000.000.000.000.000.00-0.130.02-0.010.010.000.00-0.010.01-0.000.00苯并[g,h,i]苝BgP-0.100.310.070.040.040.040.030.040.060.01-0.010.01-0.000.000.020.00-0.070.03-0.020.006-0.030.030.020.02-0.000.000.020.010.000.00多環芳烴總量Total amount of Polycyclic aromatic hydrocarbons (∑PAHs)-104.2537.6817.643.37-9.132.670.640.350.190.090.070.04-0.310.070.340.060.420.160.100.09-5.452.40-0.500.99-0.050.07-0.340.960.330.12

GLMMs中,生物非生物環境因子為固定效應,施氮量為隨機效應。bi和SE分別為廣義線性混合效應模型各因子對應的回歸系數和回歸系數的標準誤,比如,土壤含水量下面的bi和SE分別為廣義線性混合效應模型中土壤含水量的回歸系數(Regression coefficient)和回歸系數的標準誤(Standard error of the regression coefficient; SE)。苊烯Acenaphthylene(Acy)和苊Acenaphthene(Ace)兩種多環芳烴實驗中未檢測到

3.2 氮素添加對多環芳烴降解的影響

氮是植物根系和微生物的代謝過程中必不可少的元素[10,12]。活性氮量在陸地土壤中增加可以提高生物和非生物過程的多環芳烴降解速率[12]。本文中,除Acy和Ace在4個施氮梯度上均未測得其含量外,∑PAHs和其余14種優先控制多環芳烴的含量隨施氮量增加顯著減小,均在N2施氮處理(30 kg N hm-2a-1)最低。這表明,適當氮素增加可以提高荒漠草原土壤中的多環芳烴降解速率,但當氮素增加超過一定的范圍時,氮素增加開始限制多環芳烴的降解。這可能是因為多環芳烴降解在土壤中是一個復雜的過程,其可能是可用氮素含量、植物根系和微生物的代謝關系綜合作用的結果。多環芳烴在土壤中降解主要包括3個途徑：根系轉移、微生物降解和有機質的固著吸附。適量氮素添加至土壤之后,(1) 加快了根際土壤中各種形式氮素的周轉速率[37],促進植物根部對氮素和多環芳烴的吸收[13]；(2) 植物根系活性提高后,它將分泌更多有機化合物進入土壤。土壤中降解多環芳烴的微生物主要是細菌和真菌,他們的活性和多樣性對外界有機碳輸入非常敏感[23,38]。根系分泌物增加明顯能增加土壤中真菌和細菌的數量和多樣性,加速多環芳烴的降解[39]；(3) 植物根部可吸收氮素增加后,可以有效提高植物的生物量和代謝速率,植物將給土壤中輸入更多有機質[13]。土壤有機質的吸附和固著作用減少了土壤中多環芳烴含量。綜上,適量氮添加后,多環芳烴含量在氮添加梯度上顯著下降。相反,過量的氮添加對植物根部產生營養過剩的逆環境,抑制植物生長和根系分泌物的釋放,從而在根際土中產生累加效應[11,17],使得本文結果中∑PAHs和14種多環芳烴含量的最小值均在N2處理中。在氮素添加背景下,以上這3個多環芳烴生物與非生物降解的過程也可以通過生物非生物因子在氮素添加梯度上的變化得到證實。本文中,土壤含水量、pH、有機質、速效磷、總氮銨態氮、土壤微生物群落平均顏色變化率、Shannon-Wiener 指數、McIntosh均勻度、脫氫酶和脲酶的均在氮素添加梯度上存在差別。

另外,本文結果發現不同種類多環芳烴對氮添加的響應不同,說明植物根系分泌物對多環芳烴的解析和促降解兩種作用的抵消過程可能在不同類型之間存在差別。正文前文所述,植物根際效應通過有機物置換和生物酶的催化作用,能夠將土壤中顆粒表面緊密吸附的多環芳烴激活,讓其重新解析在土壤中,增加土壤中多環芳烴含量。相反,根際分泌物增加了土壤中有機質含量和微生物活性,又能夠促進多環芳烴降解,減少其含量[12-13,40]。∑PAHs和8種多環芳烴(Nap、Flu、Phe、Ant、Pyr、BbF、BkF和InP)含量在CK>N1>N3≥N2,說明在N素增加的刺激下,在4個N添加梯度上,根系分泌物對∑PAHs和這8種多環芳烴解的促進作用大于解析作用。相反,Fla、BaA、Chr、BaP、DaC和BgP在N1上值顯著大于N2和N3(P<0.05)。這說明在N素增加刺激下,在N1梯度上,根系分泌物對這6種多環芳烴的解析作用大于促降解作用。

3.3 多環芳烴降解與生物非生物因子之間的關系

廣義線性混合效應模型的回歸結果中,有機質、銨態氮、硝態氮、總氮、有效磷和脲酶活性是影響∑PAHs和14種優先控制多環芳烴含量在干旱區荒漠草地土壤中變化的最主要因素。除此之外,生物非生物因子與上述14種多環芳烴的回歸關系各不一樣,較為復雜。這說明,克拉瑪依市荒漠草地土壤中多環芳烴的降解過程是一個十分復雜的過程,除在共性上主要受到有機質、銨態氮、硝態氮、總氮、有效磷和脲酶活性的影響外,其降解效果不僅關聯著其他環境因子,還可以與自身的特性有關[5,12-13,36]。這一結論可以通過廣義線性混合效應模型的另外一個結果得到證實。本研究,低環芳烴與生物非生物環境因子之間的顯著回歸關系數明顯多于高環。這從另外一方面說明,低環數和分子量較低的多環芳烴,其降解過程較容易受到環境中生物非生物因子的影響,輕弱的環境因子變化就可以促進它的降解過程。相反,高環數和分子量較高的多環芳烴,在土壤中十分穩定,其降解過程不易受到環境的影響。

在眾多引起多環芳烴含量變化的因素之中,有機質、銨態氮、硝態氮、總氮、有效磷和脲酶活性影響種類最多。這可能是因為,干旱區荒漠草地是一個氮限制的系統[17],氮缺乏會抑制微生物和植物的生長。氮添加可以改善土壤中營養元素儲存狀態和數量,可以刺激土著微生物和植物根際微生物之間的相互作用[9-10],增加利用不同氮儲存類型降解菌的數量、促進微生物的生長和活性的增強[12,37],從而提高土壤中多環芳烴降解能力[1,12],使得多環芳烴含量與銨態氮、硝態氮、總氮之間存在顯著的回歸關系。另外,氮添加能改善土壤營養條件,它們通過刺激根部生長,提高土壤中營養利用效率,加強有機酸和碳水化合物等可溶性物質從根部滲出,為微生物的生長和活性的提高提供可利用碳源[12,41]。在這種情況下,土壤中酶和微生物的代謝活性顯著增加。因此,多環芳烴含量與有機質、有效磷、反映氮素轉化過程的脲酶活性之間存在顯著的回歸關系。

4 結論

研究結果表明,克拉瑪依市石油工業園區附近荒漠草地土壤中的LMW/HMW>1且Fla/(Fla+Pyr)在0.40—0.50之間。這說明當地多環芳烴主要為原油及其精煉的石油產品,它主要來源于石油及其精煉產品的運輸、裝卸和生產過程中的泄漏和排放。當地土壤中∑PAHs含量為(28.91±2.32) mg/kg,其值遠高于Maliszewska-Kordybach分級標準中重污染數值(∑PAHs>1000.00g/kg),克拉瑪依市荒漠草地土壤存在多環芳烴重污染。在氮素添加量增加的梯度上,∑PAHs和14種優先控制多環芳烴含量顯著降低(P<0.05),說明氮素添加能有效減小干旱區荒漠草地土壤中多環芳烴的含量。在GLMMs結果中,有機質、銨態氮、硝態氮、總氮、有效磷和脲酶活性與多環芳烴含量之間顯著相關的種對數最多,生物非生物因子與多環芳烴的回歸關系在不同種類多環芳烴間差異較大。這些都說明土壤中的多環芳烴降解是一個十分復雜的過程,它是自身屬性、根系活性和微生物群落多樣性三者之間綜合作用的結果。干旱區荒漠草地作為一個典型氮素限制生態系統,氮添加可以改善土壤中營養元素儲存狀態和數量,加速氮素的周轉速率,刺激土著微生物和植物根際微生物之間的相互作用,促進微生物的生長和活性的增強,從而提高土壤中多環芳烴降解能力。該研究有助于了解干旱區荒漠草地生態系統中氮沉降與多環芳烴降解之間關系,豐富全球變化理論,并提出解決多環芳烴污染的管理對策。