腺泡狀橫紋肌肉瘤相關基因生物信息學分析*

張汝朋，呂雷鋒，張 晨，柏傳毅，王坤正，黨曉謙

(西安交通大學第二附屬醫院骨一科，西安 710004)

橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma，RMS)是兒童最常見的顱外實體瘤之一，也是兒童和青少年最常見的侵襲性軟組織肉瘤，其預后較差[1]。腺泡狀RMS(alveolar RMS，ARMS)是RMS的一種亞型，起源于間充質細胞，其在形態學上與肺組織的腺泡相似，故稱為ARMS。 越來越多的證據表明，PAX3、FKHR、TAZ和PPP2R1A等基因的異常表達和突變參與了ARMS的發生和進展，以及相關抑癌基因的功能缺失和突變[2-3]。然而，由于在疾病早期缺乏有效的診治方法，ARMS的病死率仍然很高。因此，了解ARMS發生、增殖和復發的確切分子機制，從而制訂有效的診斷和治療策略至關重要。在過去的幾十年里，芯片與測序技術和生物信息學分析被廣泛用于篩選基因組水平的基因改變，這有助于鑒定與ARMS的癌變和進展有關的差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)。本研究從基因表達合集(gene expression omnibus,GEO)中下載并分析ARMS基因表達分析數據集，得到ARMS組織與正常組織之間的DEGs。隨后，本課題組進行了基因本體論(gene ontology，GO)、京都(日本)基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析和蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction network，PPI)網絡分析，以幫助了解致癌和促進腫瘤發展相關基因的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 ARMS的基因芯片數據GSE2787從公共數據庫GEO查找并下載(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。以Alveolar Rhabdomyosarcoma為數據檢索關鍵詞，研究類型為Expression profiling by array，限制種屬為 Homo sapiens，是1組基于Human Array 2.0芯片平臺GPL2011的數據組。此芯片共包含有14組ARMS腫瘤與正常對照樣本。

1.2方法

1.2.1數據的提取、處理及差異表達基因分析 基因表達譜的原始數據集利用R語言的affy包進行處理，rma包進行標準化，limma包進行DEGs分析，篩選出ARMS與人類胎兒骨骼肌對照組之間的DEGs。DEGs需同時滿足以下篩選條件:(1)采用t檢驗，定義P<0.01;(2) log2FC≤-1或log2FC≥1，FC表示DEGs差異倍數(fold change)。

1.2.2差異表達基因的GO功能富集分析 利用注釋、可視與集成探索的數據庫(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery，DAVID 6.8)在線分析軟件對DEGs進行GO分析，以P<0.01作為篩選條件。

1.2.3DEGs編碼蛋白相互作用網絡的構建及模塊分析 采用STRING在線數據庫，將參與GO功能富集的DEGs所編碼的蛋白進行PPI網絡分析。利用Cytoscape軟件的插件MCODE對PPI進行模塊分析，以MCODE分數大于5分作為顯著性模塊的篩選標準，并且利用DAVID在線分析工具對篩選出模塊中的關鍵基因進行功能和通路分析。

1.2.4主要觀察指標 觀察經Cytoscape篩選出PPI網絡中關鍵基因的功能與其所在信號通路。

2 結 果

2.1DEGs的篩選結果 利用R分析工具，以P<0.01，log2FC≤-1或log2FC≥1為篩選條件對DEGs進行篩選。 GSE2787數據集共篩選出DEGs 867個，其中表達上調基因737個，表達下調基因130個。

2.2DEGs的GO分析結果 通過GO功能基因富集分析，有45個基因富集分析結果呈顯著性(P<0.01，FDR<0.01)。依P值列出最小3條，DEGs主要涉及肌原纖維、肌小節、收縮纖維、肌肉收縮、橫紋肌薄絲、肌肉系統進程等功能類別，見表1。

2.3DEGs的PPI分析 為闡釋涉及ARMS的DEGs相關分子機制，使用STRING在線數據庫構建了PPI，PPI可視化圖用Cytoscape軟件繪制。PPI網絡由752個節點和5 158個交互組成。PPI中交互最密集區域(圖1)中包含35個中心節點蛋白，依次為:CSTF3、CWC25、DDX5、DHX9、ELAVL1、HNRNPA2B1、HNRNPA3、HNRNPD、HNRNPK、LSM2、LSM3、LSM7、NAA38、NCBP1、NHP2L1、PABPN1、POLR2G、POLR2I、POLR2J、PRCC、PRPF19、PRPF3、RBM5、RBM8A、SF3A3、SNRPB、SNRPD2、SNRPE、SNRPG、SRRM1、SRSF11、SRSF3、SRSF5、SRSF9、TRA2B。

2.4關鍵DEGs的GO分析與KEGG信號通路分析結果 通過GO功能基因富集分析，35個DEGs有21個富集分析呈顯著性(P<0.01，FDR<0.01)和1條信號通路分析結果呈顯著性(P<0.01，FDR<0.01)，分析結果見表2。DEGs主要涉及RNA拼接、RNA代謝過程、腺苷酯交換反應RNA剪接等生物學過程，涉及核糖核蛋白復合體、剪接體、核內腔等細胞組件，涉及RNA結合等分子功能及剪接體信號通路。

表1 DEGs的GO功能分析結果(依P值取最小3個)

BP：生物學過程;CC：細胞組分;MF：分子功能

表2 關鍵DEGs的GO功能分析結果與KEGG信號通路分析結果(依P值取最小3個)

BP：生物學過程;CC：細胞組分;MF:分子功能;PW：信號通路；hsa：人

圖1 關鍵差異基因構建的蛋白互作網絡圖

3 討 論

1978年，林華安博士結合計算機科學與生物學，開創了生物信息學的新交叉領域[4]。隨著測序技術的不斷發展，測序數據呈現爆發式增長，信息的管理和分析成為限制測序數據使用的關鍵問題，生物信息學技術應運而生且實現快速發展。

本研究從GEO數據庫下載ARMS的基因芯片數據GSE2787，其中包括14對ARMS腫瘤與正常對照樣本，經數據整理、分析，按P<0.01，log2FC≤-1或log2FC≥1為篩選條件對DEGs進行篩選，共篩選出867個DEGs，其中上調737個，下調130個。構建PPI闡釋涉及ARMS的DEGs分子機制，共得到CSTF3、CWC25、DDX5等35個中心節點蛋白，提示相應基因可能是與ARMS發生、發展密切相關的關鍵基因。對關鍵DEGs進行GO分析與KEGG信號通路分析，提示DEGs主要涉及RNA拼接、RNA代謝過程、腺苷酯交換反應RNA剪接等生物學過程，涉及核糖核蛋白復合體、剪接體、核內腔等細胞組件，涉及RNA結合等分子功能及剪接體信號通路。

與ARMS相關的功能基因研究已經有較多且深入的文獻報道。有研究發現70%～80%的ARMS中存在特異性染色體易位t(2;13)(q35;q14)和t(1;13)(p36;q14)，形成的融合基因PAX3/7-FKHR可以抵制腫瘤細胞凋亡，促使增殖，對于ARMS的發生機制研究、診斷、靶向治療、預后判斷等都具有重要意義[5-7]。有文獻報道PAX3/FOXO1融合負調控的PPP2R1A促進PAX3/FOXO1陽性ARMS的侵襲行為[3]。染色質域解旋酶DNA結合蛋白4(CHD4)結合到PAX3-FOXO1靶基因的調控區域，CHD4的缺失降低了融合陽性細胞的生存能力，但未降低融合陰性細胞的生存能力，導致了體內融合陽性異種移植瘤的特異性回歸，是PAX3-FOXO1活性的關鍵核心調控因子[8]。卷曲相關蛋白SFRP3可抑制ARMS細胞的生長，減少其增殖，同時伴有G1阻滯和p21的誘導，誘導細胞凋亡，抑制SFRP3除了增加肌源性分化和連環蛋白信號外，還將ARMS的生長和質量降低了3倍以上[9]。組蛋白乙酰轉移酶P/CAF(KAT2B)在ARMS患者的原發性腫瘤中過表達，但是在融合陽性的ARMS細胞系中，P/CAF乙酰化并穩定PAX3-FOXO1，沉默P/CAF，或對其乙酰轉移酶活性的藥理學抑制，在移植瘤模型中下調PAX3-FOXO1水平，同時減少增殖和腫瘤負擔[10]。然而，Sphingosine在PAX3-FKHR陽性ARMS細胞中，通過MYCN下調獨立于TP53突變狀態，發揮了抗增殖和促凋亡作用[11]。轉錄因子SNAIL表達在ARMS中升高，表現為肌原性分化程度低、侵襲性強,SNAIL水平與MYF5表達呈負相關，沉默SMAIL使MYF5重新表達和MYOD經典結合，促進ARMS細胞的肌原性分化，提示SNAIL是一種重要的肌源性分化調節劑[12]。TAZ抑制ARMS細胞增殖，誘導凋亡，支持肌原性分化，降低ARMS細胞活性，TAZ缺陷的ARMS細胞在細胞周期的G2-M期富集，提示TAZ是ARMS發生的致瘤因子[2]。GSK3β抑制或外源性表達的S160/164A突變肌原蛋白減少了RH30細胞在集落形成實驗中的自主錨定生長，提示GSK3β抑制了肌源級聯的關鍵調控步驟，導致ARMS未分化、增殖表型[13]。目前ARMS相關功能基因研究多關注于融合基因及腫瘤的肌原分化，與本研究通過生物信息學分析預測所得關鍵DEGs的肌肉收縮、核糖核蛋白復雜裝配、大分子復雜亞基組織、單核苷酸突變、剪接體等功能類別相符。但是對本研究預測的功能相關可能性較高的RNA拼接、剪接、結合等功能類別研究較少，提示可以在將來研究中考慮RNA功能尤其是RNA拼接、剪接、結合等功能類別在ARMS發生、發展中的作用與相關機制。

與ARMS相關的信號通路研究報道卻較少。有研究表明肝細胞生長因子(HGF)刺激不能促進ARMS細胞系的增殖，HGF刺激細胞的活力不是被ERK1 siRNA抑制，而是被ERK2 siRNA抑制，提示HGF/MET信號主要通過ERK2信號促進ARMS細胞的運動[14-15]。藥物對NF-κB活性的抑制導致許多ARMS腫瘤培養物的細胞增殖減少；然而，用ARMS腫瘤細胞進行原位同種異體移植的小鼠在使用NF-κB抑制劑時腫瘤生長與對照組相比沒有差異。當與NF-κB抑制劑聯合使用時，navitoclax在減少人類和IKKbeta野生型小鼠ARMS細胞的生長方面具有協同作用，提示僅NF-κB的滅活可能不足以減少腫瘤的生長，但如果與另一種靶向治療結合使用，可能具有益處[16]。本研究所預測的信號通路剪接體(hsa03040:Spliceosome)信號通路目前尚未有在ARMS中的研究報道，提示在將來進行ARMS發生與發展研究時可以考慮剪接體信號通路是否發揮作用及相關機制。

綜上所述，本研究旨在識別可能參與ARMS發生或進展的DEGs。共鑒定867個DEGs和35個關鍵DEGs，可作為診斷ARMS的生物標志物的參考范圍。然而，需要進一步研究和闡明這些基因在ARMS中的生物學功能。