藤茶總黃酮調控TGF-β1/Smad信號通路抗肝纖維化機制的研究*

張文濤，吳先昊，梁冰潔，甘彩玉，鄭作文△

(1.廣西中醫藥大學藥理教研室，南寧 530200；2.江西省中醫藥研究院中藥藥理室，南昌 330046)

藤茶總黃酮(tengcha flavonoids，TF)為葡萄科蛇葡萄屬顯齒蛇葡植物中提取的黃酮類成分。藤茶在民間常有應用，是重要的民族用藥。主要用于治療急性結膜炎、感冒發熱、咽喉腫痛、肝炎等疾病[1]。本課題組前期藥理研究表明，TF具有明顯地抗肝纖維化的作用[2]，但其機制未明，本研究通過應用TF灌胃來干預小鼠肝纖維化模型，探討TF抗肝纖維化的機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 昆明種小鼠98只，雌雄兼用，體質量(20±2)g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，合格證號：SYXK桂2014-002。

1.1.2藥物與試劑 TF由廣西中醫藥大學中藥化學教研室提供；秋水仙堿購自北京索萊寶科技有限公司(批號：505A0316)；金龍魚花生油(批號：20151029)，四氯化碳(CCl4)購自廣東西隴化工廠(批號：20150511)；丙氨酸氨基轉移酶(ALT)試劑盒(批號：20160725)；天冬氨酸氨基轉移酶(AST)試劑盒(批號：20160723)，均購自南京建成生物科技有限公司。Ⅰ型膠原蛋白(ColⅠ)試劑盒(批號：201606)，Ⅲ型膠原蛋白(ColⅢ)試劑盒(批號：201606)，轉化生長因子-β1(TGF-β1)試劑盒(批號：201608)，均購自美國R&D公司。兔單克隆抗體α-SMA Lot：GR212262-19，兔多克隆抗體TGF-β1 Lot：GR121841-15，兔單克隆抗體Smad2 Lot：GR269028-1，兔單克隆抗體Smad3 Lot：GR169548-20，兔單克隆抗體Smad4 Lot：GR261313-2，兔單克隆抗體Smad7 Lot：GR241822-21，均購自美國abcan公司。MaxVisonTM試劑盒(批號：160912409C)購自福州邁新生物技術開發有限公司，DAB顯色試劑盒(批號：K165920D)購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.1.3實驗儀器 EPOCH型酶標儀購自美國BIO-TEK公司，ST16型離心機購自美國Thermo Fisher公司，BP211D型電子天平購自德國賽多利斯公司，明澈-D24UV型超純水儀購自法國默克密理博公司，Donatello型自動組織處理機購自意大利Diapath.S.p.A公司，Shandon Histocentre 3型組織包埋機購自美國Thermo Fisher公司，RM2235型 組織切片機購自德國Leica公司，YT-7FB型生物組織攤烤片機購自亞光醫用電子技術有限公司，DM2500型 顯微鏡購自德國Leica公司，KK24T18TI型冰箱購自德國SIEMENS公司。

1.2方法

1.2.1動物分組 取昆明種小鼠98只，根據性別采用“均衡隨機”方法分為6組，分別為對照組、模型組、秋水仙堿組(0.2 mg/kg)，TF高劑量組(300 mg/kg)、TF中劑量組(150 mg/kg)、TF低劑量組(75 mg/kg)，其中模型組28只小鼠(因前期研究發現模型組小鼠實驗過程中會出現死亡的現象)，其余每組14只。除對照組外，其余各組小鼠背部皮下注射25% CCl4花生油溶液，2 mL/kg，每3天1次，連續10周[3]；對照組背部皮下注射等量100%花生油溶液(每3天1次，連續10周)。造模同時對照組和模型組小鼠給予蒸餾水灌胃，其余各組給予相應藥物灌胃給藥，給藥體積為20 mL/kg，每天1次，連續10周。末次給藥1 h后摘眼球取血，室溫靜置1 h后，2 500 r/min離心10 min取上清液，分裝于-80 ℃冰箱保存備用。實驗結束后，各組小鼠處死，迅速取肝組織，生理鹽水洗滌，取部分肝組織剪碎，勻漿，然后轉入EP管中，靜置，離心，取上清液進行分裝，-80 ℃冰箱保存備用，另取肝臟左葉浸入4%甲醛溶液中備用。

1.2.2血清生化指標檢測 血清生化指標ALT和AST水平檢測嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.3ColⅠ、ColⅢ水平檢測 ELISA法檢測肝組織中ColⅠ，ColⅢ水平，取分裝好的肝組織勻漿，嚴格按照試劑盒說明書測定肝組織中ColⅠ，ColⅢ水平。

1.2.4免疫組織化學法(IHC)檢測 IHC檢測肝組織中TGF-β1、Smad2、Smad4、Smad7及α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)蛋白的表達情況，石蠟切片常規脫蠟后，3% H2O2滅活內源性酶，室溫孵育20 min，微波進行抗原修復，10 min后5%牛血清封閉，加兔抗鼠一抗，4 ℃孵育過夜。TGF-β1 1∶250稀釋液，Smad2 1∶100稀釋液，Smad4 1∶100稀釋液，Smad7 1∶100稀釋液。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗做陰性對照，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，切片經梯度乙醇脫水干燥(二甲苯透明)，中性樹膠封固。IHC切片用Leica DM2500顯微鏡觀察，組織中出現黃褐色為陽性，每張免疫組化切片隨機選取5個視野拍照，用ImageJ2x 進行掃描，以平均光密度和陽性染色面積百分比作為蛋白的相對表達水平。

2 結 果

2.1實驗動物情況 對照組小鼠皮毛光滑油亮，濃密而有光澤，形態較為豐滿，活動迅速靈敏，眼睛靈動明亮，食欲良好；模型組小鼠毛發稀疏，毛色暗黃且無光澤，體型消瘦，活動稍顯遲緩，眼睛渾濁，食欲較差。TF低劑量組小鼠被毛稍顯暗淡，體型稍偏瘦，行動較對照組小鼠稍遲鈍，食欲正常，其肝臟為暗淡的紅褐色，被膜欠細膩，質地稍硬，偶見邊緣圓鈍。TF高、中劑量組小鼠肉眼觀察毛發較為濃密，毛色光澤，體型較為豐滿，食欲較好，其肝臟為紅褐色，被膜較光滑細膩，質地柔軟，邊緣光整。第9周末隨機取模型組、對照組小鼠各2只，解剖觀察，制作HE染色，觀察發現對照組小鼠肝細胞細胞質飽滿，肝細胞沿肝索整齊排列。模型組的兩只小鼠肝臟呈灰紅色，被膜表面粗糙，質地稍硬，邊緣圓鈍，肝組織中纖維化明顯，有假小葉的形成。病理結果表明肝纖維化模型建立成功。第10周末取指標，實驗過程中模型組出現3只小鼠死亡，其中雌性1只，雄性2只。尸檢及肝臟HE染色檢查，死因均為急性肝衰竭，死亡動物不計入統計學處理。對照組最少動物數為12只，其他各組根據性別采取“均衡隨機”方法隨機測量12只小鼠肝纖維化相關指標，以便后期更好分析。

表1 各組小鼠血清ALT，AST活性及肝組織中ColⅠ，ColⅢ水平比較

a：P<0.05，與對照組比較；b:P<0.05，與模型組比較；c:P<0.05，與秋水仙堿組比較

表2 各組小鼠肝臟組織中TGF-β1、Smad2、Smad4、Smad7、α-SMA蛋白平均光密度比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與秋水仙堿組比較

A:對照組；B：模型組；C：秋水仙堿組；D：TF高劑量組；E：TF中劑量組；F：TF低劑量組

圖1 顯微鏡下各組小鼠TGF-β1蛋白在肝細胞中的表達(IHC，×400)

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與秋水仙堿組比較

A:對照組；B：模型組；C：秋水仙堿組；D：TF高劑量組；E：TF中劑量組；F：TF低劑量組

圖2顯微鏡下各組小鼠Smad2蛋白在肝細胞中的表達(IHC，×400)

A:對照組；B：模型組；C：秋水仙堿組；D：TF高劑量組；E：TF中劑量組；F：TF低劑量組

圖3顯微鏡下各組小鼠Smad4蛋白在肝細胞中的表達(IHC，×400)

2.2各組小鼠肝功能指標及肝組織中ColⅠ、ColⅢ水平比較 模型組、秋水仙堿組、TF高、中、低劑量組小鼠血清ALT、AST均高于對照組(P<0.05)，秋水仙堿組、TF高、中劑量組低于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)，但TF改善肝功能效果并不優于秋水仙堿。與模型組比較，TF高、中劑量組及低劑量組ColⅠ，ColⅢ水平明顯降低(P<0.05)，見表1。

A:對照組；B：模型組；C：秋水仙堿組；D：TF高劑量組；E：TF中劑量組；F：TF低劑量組

圖4顯微鏡下各組小鼠Smad7蛋白在肝細胞中的表達(IHC，×400)

A:對照組；B：模型組；C：秋水仙堿組；D：TF高劑量組；E：TF中劑量組；F：TF低劑量組

圖5顯微鏡下各組小鼠α-SMA蛋白在肝細胞中的表達(IHC，×400)

2.3各組小鼠肝組織中TGF-β1、Smad2、Smad4、Smad7、α-SMA蛋白表達水平比較 TGF-β1蛋白IHC結果顯示，對照組小鼠TGF-β1在肝臟組織中表達較少，模型組中可見廣泛表達于肝細胞細胞質及匯管區增生的纖維細胞細胞質中；秋水仙堿組在肝細胞細胞質中仍有較明顯表達，但與模型組相比有明顯地減少；TF高、中、低劑量組TGF-β1在肝細胞細胞質中的表達與模型組相比均有所減少，其中TF中劑量組的減少更為明顯(P<0.05)，見圖1。Smad2蛋白IHC結果顯示，對照組小鼠Smad2僅少量表達于細胞核中；模型組可見廣泛表達于細胞核中；秋水仙堿組Smad2在肝細胞核中表達與模型組相比有所減少；TF高、中、低劑量組Smad2在細胞核膜中的表達與模型組相比均有所減少，其中TF高、中劑量組中減少更為明顯，見圖2。Smad4蛋白IHC結果顯示，對照組較少地表達于細胞核核膜；模型組中可見Smad4廣泛地表達于大部分細胞核核膜中；秋水仙堿組在肝細胞核中的表達與模型組相比有所減少，但差異無統計學意義(P>0.05);TF高、中劑量組在肝細胞細胞核及核膜中的表達與模型組相比均有所減少，其中TF高劑量組減少更為明顯(P<0.05)，見圖3。Smad7蛋白IHC結果顯示，對照組小鼠較多地表達于細胞質和細胞核核膜；模型組較少地表達于細胞核核膜中，細胞質中表達的更少；TF高劑量組與模型組平均光密度比較差異有統計學意義(P<0.05);秋水仙堿組及TF中、低劑量組在肝細胞細胞質和細胞核核膜中表達與模型組相比均有所增加，但差異無統計學意義(P>0.05);蛋白陽性表達面積結果顯示，TF高、中、低劑量組與模型組相比表達量均明顯增加，其中TF高劑量組增加的更為明顯，見圖4。α-SMA蛋白IHC結果顯示，對照組僅少量地表達于血管壁；模型組中α-SMA大量表達于肝門靜脈及假小葉的纖維間隔區域；秋水仙堿組少量地表達于門靜脈及匯管區；TF高、中、低劑量組與模型組相比蛋白平均光密度均明顯降低(P<0.05)；蛋白陽性表達面積結果顯示，TF高、中、低劑量組與模型組相比均明顯性降低，其中TF高劑量組減少更為明顯(P<0.05)，見圖5。各組小鼠肝組織中TGF-β1、Smad2、Smad4、Smad7及α-SMA蛋白表達水平比較，見表2、3。

3 討 論

本課題組前期對TF的藥理藥效進行了廣泛的研究，發現其具有抗炎、保肝降酶、抗病毒、抗腫瘤等作用[2-3]，TF保肝降酶、抗肝纖維化的研究集中在藥理藥效，其作用機制仍不清楚[4-7]。本研究采用CCl4復制小鼠肝纖維化模型，具有成模率高，病變典型等特點。其機制為CCl4經肝微粒體的細胞色素P450代謝生成的三氯甲基自由基攻擊細胞膜上磷脂分子引起脂質過氧化，三氯甲基自由基繼而與細胞膜脂質和蛋白大分子進行共價結合，引起膜結構和功能完整性的破壞[8]。ALT、AST存在于機體的臟器和組織中，ALT水平從高到低分布的次序大致為肝、腎、心、肌肉；AST水平從高到低分布的次序大致為心、肝、肌肉、腎。在肝臟ALT主要分布在細胞質內，AST則分布于細胞質和線粒體中。肝組織中的細胞外基質(ECM)主要含有ColⅠ、ColⅢ，兩種膠原蛋白的占比變化反映著肝纖維化的病情發展情況。肝臟在損傷過程的同時，激活了一系列的應激反應，肝纖維化相關的細胞因子的合成和釋放增加，其中TGF-β1是與肝纖維化的形成最為密切的細胞因子之一[9-10]。肝星狀細胞(HSC)的激活是肝纖維化的核心環節，活化的HSC增大、增殖，維生素A水平降低，表型發生改變并大量表達α-SMA作為骨架蛋白。活化的HSC由過渡型最終轉化為成纖維類的肌成纖維細胞，使得膠原蛋白的合成增加降解減少[11]。TGF-β1能夠激活HSC，促進肝臟膠原蛋白的合成，抑制ECM的降解，導致肝臟纖維化形成。

TGF-β1是TGF-β超家族中的一員，哺乳動物TGF-β分為TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3 3種，其中TGF-β1在肝臟中水平最高且具有生物活性，肝臟損傷時HSC是TGF-β的主要來源。TGF-β受體(TBR)同樣存在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3種類型，其中Ⅰ型和Ⅱ型為絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶，其和TGF-β1的親和力比TGF-β2的親和力強。TβRⅡ在細胞質內具有Ser/Thr激酶區，其細胞外端首先與配體結合，細胞內段的Ser/Thr激酶被活化，被配基耦合的TβRⅡ使Ⅰ型受體近膜區GS結構域磷酸化，進而將生物信號向細胞內轉導[12-13]。 TβRⅢ無激酶活性，主要作用是調節TβRⅡ的膜上表達及配體與受體的親和力，不直接參與TGF-β1/Smad細胞信號通路傳遞。TGF-β1是TGF-β1/Smad信號轉導通路中的啟動因子，TGF-β1連續激活TβRⅡ、TβRⅠ，TβRⅠ使質-核信號分子Smad2/3磷酸化，磷酸化的Smad2/3與Smad4結合，以R-Smad-Smad4三聚體的形式進入核內，最終與染色質形成核復合物，調控基因表達。Smad最初在果蠅中發現，統稱為Smads蛋白家族。脊椎動物中Smad成員，分為3類，(1)受體激活的Smad(R-Smad)，包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8亞型。(2)通用型Smad(Co-Smad),目前只有Smad4。(3)抑制型Smad(I-Smad)，包括Smad6、Smad7，其能與受體結合但C端功能區缺乏磷酸化位點，并且缺少MH1功能區無法與染色質有效結合，是信號轉導中的抑制因子，競爭性抑制R-Smad與TβR結合[14]。TβRⅠ-SA RA-Smad復合體形成后，TβRⅠ激酶將Smad蛋白C端MH2上SSXS基序中色氨酸磷酸化，從而使Smad2/3活化，Smad2/3繼而與TβR及SARA解離，同時與Smad4形成雜聚體，進入細胞核，調節轉錄。 TGF-β1/Smad通路通過與C-Jun/C-Fos及P300/CBP等基因轉錄調節因子的協同作用激活膠原酶Ⅰ等膠原相關基因的轉錄[15-16]。STRAP蛋白可與TβRⅠ、Ⅱ連接，又與Smad7特異性聚合并將其運送至活化的TβRⅠ，使TβRⅠ-Smad7復合體形成及穩定，從而阻止Smad2、3與受體結合。

本研究結果顯示，與模型組比較，TF通過抑制肝纖維化小鼠肝組織中TGF-β1的過表達，從而抑制HSC的激活，進而阻斷肝纖維化的發展，使肝組織炎癥、膠原纖維增生情況明顯減輕。IHC結果顯示，其中TF高、中、低劑量均能不同程度下調肝臟組織中TGF-β1、Smad2、Smad4蛋白的表達，并能上調Smad7蛋白的表達。TF下調肝臟組織中α-SMA蛋白的表達，抑制ColⅠ，ColⅢ的合成，促進ECM的降解。

綜上所述，TF可能是通過調控TGF-β1/ Smad信號通路中相關蛋白的表達，從而發揮抗肝纖維化的作用。