苯扎貝特聯(lián)合順鉑抑制肺腺癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)及其機(jī)制研究*

王桂平，李智斌，張彥燾，劉新艷

(1.廣州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系，廣州 510180；2.廣州醫(yī)科大學(xué)雜志社，廣州 510182)

肺癌是世界上癌癥患者死亡的主要原因之一，對(duì)人類(lèi)健康和生命威脅很大。早期手術(shù)仍是肺癌治療最為有效的方法，但不幸的是，70%的肺癌發(fā)現(xiàn)時(shí)已進(jìn)展為晚期，失去了手術(shù)治療最佳時(shí)期。化療是目前失去手術(shù)機(jī)會(huì)的肺癌治療的主要手段，但腫瘤多藥耐藥的產(chǎn)生成為化療的主要阻礙，因此，發(fā)現(xiàn)新的高效低毒的治療藥物，對(duì)延長(zhǎng)肺癌患者的生命及降低死亡率有著迫切的臨床需要。 過(guò)氧化物酶增殖激活受體 (peroxisome proliferator activated receptor,PPAR)屬于核激素受體超家族的成員，包括PPARα、PPARγ和PPARδ 3種亞型 ，其中PPARα主要參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝與糖代謝等生物學(xué)過(guò)程。有研究表明，PPARα受體通路也與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展關(guān)系密切，PPARα受體激動(dòng)劑被發(fā)現(xiàn)可抑制肺癌、結(jié)腸癌、白血病、黑色素瘤及乳腺癌等腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[1-4]。PPARα受體激動(dòng)劑在腫瘤領(lǐng)域的研究逐漸受到重視，然而其抗腫瘤機(jī)制尚不清楚,有研究認(rèn)為可能與降低三酰甘油、改善胰島素抵抗、抗血管生成及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等有關(guān)[5]。苯扎貝特(bezafibrate，BEZ)是目前臨床常用的一種貝特類(lèi)降脂藥，也是一種重要的PPARα受體特異性激動(dòng)劑，本研究以順鉑(cisplatin，DDP)為陽(yáng)性藥物，觀察BEZ單用和聯(lián)合DDP對(duì)人肺腺癌A549裸鼠移植瘤的抑瘤作用，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購(gòu)自中山大學(xué)細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，并在37 ℃，5% CO2的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代備用。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/C-NU小鼠(SPF級(jí))24只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(NO：11400700063292)。SPF級(jí)鼠料購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供應(yīng)(合格證號(hào)：0082700)。鼠齡4～6周，體質(zhì)量16～18 g，雄性，飼養(yǎng)于超凈生物層流架內(nèi)，溫度控制在(22±3)℃，濕度控制在(50±20)%，燈光每天控制12 h開(kāi)燈/12 h黑暗循環(huán)。

1.1.3儀器和試劑 蘇州安泰潔凈工作臺(tái)(SW-CJ-IFD)，倒置光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS CKX41,U-CTR30-2),細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(Thermo scientific,HERACELL150i)，智能型獨(dú)立通氣籠IVC系統(tǒng)(IS7，蘇杭科技器材有限公司)及流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson，美國(guó))。胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、青霉素及鏈霉素等均購(gòu)自Hyclone； BEZ和DDP購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2方法

1.2.1荷瘤裸鼠模型建立 將A549細(xì)胞懸液(濃度為5×107個(gè)/mL)接種于右側(cè)腹部皮下，每鼠0.1 mL，即每鼠接種5×106個(gè)活細(xì)胞。接種后每日觀察裸鼠的飲食、活動(dòng)、局部紅腫及潰破等情況，按規(guī)定時(shí)間測(cè)量腫瘤體積。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組及給藥 當(dāng)腫瘤的平均體積達(dá)到100 mm3時(shí)，開(kāi)始干預(yù)治療。24只荷瘤小鼠被隨機(jī)分為4組：即對(duì)照組(生理鹽水)、BEZ組(200 mg/kg BEZ)、DDP組(2 mg/kg DDP)及聯(lián)合組(200 mg/kg BEZ+2 mg/kg DDP)，每組6只。DDP采用腹腔注射，BEZ采用灌胃方法，每天1次，持續(xù)3周。 實(shí)驗(yàn)期間注意觀察裸鼠精神狀況、進(jìn)食、排便及體質(zhì)量情況，實(shí)驗(yàn)3周后處死小鼠。

1.2.3移植瘤體積測(cè)量 每3天稱(chēng)量小鼠體質(zhì)量1次，用游標(biāo)卡尺測(cè)量皮下移植瘤的長(zhǎng)徑(a)和 短徑(b)，并按公式計(jì)算腫瘤體積：腫瘤體積(mm3)=[長(zhǎng)度(mm)×寬度(mm)2]/2

1.2.4移植瘤質(zhì)量和抑瘤率測(cè)定 實(shí)驗(yàn)3周后，以頸椎脫位方式處死各組裸鼠，完整剝離腫塊，去除血污、脂肪等非瘤組織,稱(chēng)取瘤體質(zhì)量，并計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率(IR)：IR(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均質(zhì)量/對(duì)照組平均質(zhì)量)×100%

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取新鮮移植瘤組織，置于8 mL冰磷酸鹽緩沖液(PBS)緩沖液中，用剪刀剪碎及充分勻漿， 以350目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，制成細(xì)胞懸液。 1 500 r/min離心5 min后，去除上清液，收集細(xì)胞，以70%的乙醇固定，置于4 ℃冰箱保存。 按項(xiàng)目前期研究及試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行凋亡檢測(cè)[6]，加入5 μL的膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和5 μL的碘化丙啶(PI)， 4 ℃避光反應(yīng)30 min后， 采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，計(jì)算總體凋亡細(xì)胞的比例。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-qPCR)檢測(cè) 取腫瘤組織加入1 mL Trizol，冰浴充分研磨后，吸取組織勻漿液于4 ℃、3 000 r/min 條件下離心 15 min， 取上清液 。RT-qPCR擴(kuò)增條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s、72 ℃延伸30 s，進(jìn)行40次循環(huán)。NF-κB1上游引物：5′-CCA CCC GGC TTC AGA ATG G-3′，下游引物：5′-GGT ATG GGC CAT CTG CTG TT-3′；白細(xì)胞介素(intedeukin,IL)-6上游引物：5′-TGC AAT AAC CAC CCC TGA CC-3′，下游引物：5′-GTG CCC ATG CTA CAT TTG CC-3′；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)上游引物：5′-TGA ACT ACG TCC TGT CCC CT-3′，下游引物：CTC TTC TCT TGG GTC TCC GC-3′；環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)上游引物：5′-GTT CCA CCC GCA GTA CAG AA-3′，下游引物：5′-AGG GCT TCA GCA TAA AGC GT-3′；β-actin上游引物：5′-GTT GCG TTA CAC CCT TTC TTG-3′，下游引物：5′-GTC ACC TTC ACC GTT CCA GT-3′。按公式2-ΔΔCt計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1BEZ及其聯(lián)合DDP對(duì)肺癌移植瘤的抑瘤作用 裸鼠皮下接種A549細(xì)胞懸液約5 d后，皮下可見(jiàn)腫瘤形成，20 d左右腫瘤體積達(dá)100 mm3。裸鼠的飲食和活動(dòng)正常，局部無(wú)異常紅腫及潰破等情況,給藥前各組移植瘤體積比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組裸鼠的移植瘤體積隨時(shí)間增加不斷增大，但藥物干預(yù)治療組移植瘤體積增加緩慢，呈不同程度生長(zhǎng)抑制。DDP組在用藥第9～21天對(duì)移植瘤的生長(zhǎng)具有明顯抑制作用，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；BEZ抑瘤作用起效較慢，在用藥15 d后其移植瘤體積與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合組抑瘤作用最明顯，腫瘤體積增加最為緩慢，用藥第12～21天與BEZ或DDP組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。各實(shí)驗(yàn)組均不同程度抑制移植瘤的生長(zhǎng)，BEZ和DDP組抑瘤率分別為27.69% 和38.46%，各實(shí)驗(yàn)組間抑瘤率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，特別是聯(lián)合組抑瘤作用最明顯，抑瘤率達(dá)52.30%，與BEZ或DDP組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與BEZ、DDP組比較

圖1各組裸鼠肺癌A549細(xì)胞移植瘤體積比較

2.2BEZ及其聯(lián)合DDP對(duì)裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡影響 采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各處理組細(xì)胞凋亡情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BEZ可誘導(dǎo)裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡，其腫瘤細(xì)胞凋亡率為(11.74±1.21)%，與對(duì)照組(4.37±0.52%)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 BEZ能增強(qiáng)DDP的凋亡誘導(dǎo)作用，聯(lián)合組凋亡率為(43.24±4.83)%，與BEZ組[(11.74±1.21)%]、DDP組[(29.56±2.50)%]比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

表1 各組平均瘤質(zhì)量與抑瘤率比較(n=6)

a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與聯(lián)合組比較

a：P<0.05,與對(duì)照組比較;b:P<0.05,與BEZ、DDP組比較

圖2各組裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡比較

2.3BEZ及其聯(lián)合DDP對(duì)移植瘤炎癥因子表達(dá)影響 通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)裸鼠移植瘤組織中相關(guān)炎癥相關(guān)因子表達(dá)，結(jié)果表明，BEZ能有效抑制移植瘤組織中IL-6、iNOS及COX-2 mRNA的表達(dá)水平，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。BEZ聯(lián)合DDP對(duì)IL-6、iNOS及COX-2 mRNA的表達(dá)產(chǎn)生明顯抑制作用，與對(duì)照組比較，聯(lián)合組裸鼠IL-6和iNOS mRNA的表達(dá)下調(diào)約3倍，COX-2 mRNA的表達(dá)下調(diào)約2倍。此外，BEZ也一定程度抑制NF-κB1基因的表達(dá)，但與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

a：P<0.05,與對(duì)照組比較；b：P<0.05,與BEZ組比較

圖3各組裸鼠移植瘤組織中炎癥因子表達(dá)水平比較

3 討 論

PPARα受體通路與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切，已有研究發(fā)現(xiàn)，多種人類(lèi)腫瘤細(xì)胞上均不同程度表達(dá)PPARα受體,PPARα激活劑已被證實(shí)對(duì)多種人類(lèi)腫瘤，包括肝癌，黑色素瘤及子宮內(nèi)膜癌等腫瘤具有抗癌作用[1-5]。BEZ屬于PPARα激活劑，廣泛應(yīng)用于臨床降脂治療，對(duì)控制動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病、缺血再灌注損傷等有較好療效。本課題組前期研究表明，BEZ可有效抑制肺腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)的表達(dá)有關(guān)，并且BEZ聯(lián)合DDP對(duì)肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有協(xié)同抑制效應(yīng)[7]。為探討B(tài)EZ或聯(lián)用DDP的體內(nèi)抗肺腺癌，本研究通過(guò)肺腺癌A549細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，觀察BEZ及聯(lián)用DDP的體內(nèi)抑瘤效應(yīng)，結(jié)果表明，與陽(yáng)性藥物DDP比較，BEZ體內(nèi)抑瘤較弱，但仍可有效抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，其抑瘤率為27.69%；當(dāng)BEZ聯(lián)用DDP時(shí)，可產(chǎn)生明顯的抑瘤作用，其抑瘤率達(dá)到52.30%，提示BEZ聯(lián)用DDP可能產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用，此與本項(xiàng)目前期體外研究相吻合[7]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，PPARα激活劑(包括BEZ)對(duì)非小細(xì)胞肺癌原發(fā)癌和轉(zhuǎn)移癌均具有較好的抑制作用[8]。此外，臨床研究也發(fā)現(xiàn)，BEZ可改善白血病患者的療效，表明BEZ等PPARα激活劑可能在肺癌等腫瘤治療領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景[9]。

PPARα抗腫瘤作用的確切機(jī)制仍不清楚。有研究表明，PPARα激活劑的抗腫瘤作用認(rèn)為可能與改善胰島素抵抗、抗血管生成、抗炎及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等有關(guān)[1-5]。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是許多抗癌藥物抑制腫瘤生長(zhǎng)的重要機(jī)制。文獻(xiàn)報(bào)道，PPARα激活劑可通過(guò)多種機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗癌作用。例如PPARα激活劑非諾貝特誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡可能與抑制NF-κB功能、上調(diào)叉頭轉(zhuǎn)錄因子O3a(FOXO3a)表達(dá)及抑制線粒體呼吸鏈功能而上調(diào)活性氧(ROS)等有關(guān)[10]。本研究結(jié)果表明，BEZ可誘導(dǎo)移植瘤細(xì)胞凋亡，并且當(dāng)BEZ聯(lián)合DDP后，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用明顯增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡率達(dá)到(43.24±4.83)%，表明細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)可能是BEZ發(fā)揮抗肺癌作用機(jī)制之一。本研究也觀察到BEZ也可抑制NF-κB1基因的表達(dá)，但抑制作用較弱，而聯(lián)合DDP后，NF-κB1基因表達(dá)下調(diào)較明顯。BEZ是否通過(guò)干擾NF-κB功能而發(fā)揮細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用，此需要進(jìn)一步深入研究。

腫瘤炎癥微環(huán)境的形成與腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展關(guān)系密切，炎癥因子介導(dǎo)的信號(hào)通路參與了腫瘤細(xì)胞的惡性演進(jìn)，因此抑制腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子或炎癥因子可產(chǎn)生良好的抗腫瘤效應(yīng)。NF-κB是調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的重要因子，可調(diào)節(jié)IL-1、IL-6等多種細(xì)胞因子的表達(dá)，在炎癥反應(yīng)方面起著重要作用[11]。IL-6是炎癥網(wǎng)絡(luò)的核心因子，主要參與腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、分化、血管生成和微環(huán)境免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程。此外，腫瘤炎癥微環(huán)境中iNOS和COX-2高表達(dá)與活化，也參與與血管生成、炎癥及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等過(guò)程[12-13]。現(xiàn)有研究表明，多種PPAR-α激動(dòng)劑具有良好的抗炎作用，例如非諾貝特可通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮抗炎作用，其抗炎作用可能與抑制NF-κB活性、抑制多種IL分泌(例如IL-2、IL-6、IL-4、IL-5等)及下調(diào)COX-2和iNOS的表達(dá)等有關(guān)[8,10，14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BEZ可降低移植瘤組織中炎癥因子IL-6、iNOS及COX-2 mRNA的表達(dá)水平，特別是，與DDP聯(lián)用可產(chǎn)生更強(qiáng)的抗炎作用，提示BEZ可能通過(guò)抑制腫瘤微環(huán)境中IL-6、iNOS及COX-2等細(xì)胞因子的表達(dá)，從而產(chǎn)生抗腫瘤作用。BEZ的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用是否與BEZ的上述抗炎作用相關(guān)，需要進(jìn)一步研究。NF-κB為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，由Rel(cRel)、p65(RelA,NF-κB3)、RelB、p50(NF-κB1)和p52(NF-κB2)等5個(gè)亞單位組成。本研究結(jié)果顯示，BEZ對(duì)NF-κB1基因的表達(dá)抑制作用較弱，但該藥是否對(duì)NF-κB其他亞單位的表達(dá)和活性產(chǎn)生影響，BEZ是否通過(guò)NF-κB途徑抑制IL-6等炎癥因子表達(dá)，均需要進(jìn)一步證據(jù)。

綜上所述，BEZ可有效抑制A549細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，當(dāng)與DDP聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，產(chǎn)生更強(qiáng)的抗腫瘤用，提示PPARα受體可能是新的肺癌治療靶點(diǎn)。貝特類(lèi)藥物如BEZ，由于其具有的良好耐受性和不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，若能與DDP等一線肺癌治療藥物聯(lián)用產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用，則具有重要臨床意義。