烏司他丁對人卵巢癌HO-8910PM細胞轉移和侵襲的影響*

李 燕，李貴妃

(1.成都市婦女兒童中心醫院婦產科，成都 610031；2.湖南師范大學醫學院，長沙 410006)

卵巢癌是發病率位居第三而死亡率最高的婦科腫瘤，由于其早期癥狀不明顯，早期診斷方法不成熟，因而早期即可發生廣泛轉移，發現時超過70%的患者已屬晚期，由于廣泛的腹腔轉移而無法手術根治[1]。腫瘤細胞的遷移、侵襲和對基質的降解是卵巢癌發生轉移的三大步驟[2]。其中，在腫瘤細胞穿透基底膜并降解細胞外基質的這個關鍵步驟中，多種蛋白酶發揮著至關重要的作用，尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator,uPA)就是其中之一[3]。

烏司他丁(ulinastatin,UTI)作為尿激酶抑制劑，是一種從人類尿液中提取純化的糖蛋白，能有效抑制多種蛋白酶的活性，因而被廣泛應用于彌散性血管內凝血、休克和胰腺炎等疾病的治療[4]。UTI還具有抗腫瘤的作用，已有研究證實其對乳腺癌、人口腔表皮樣癌、結腸癌等多種腫瘤細胞具有明顯的抑制遷移和侵襲的能力，且其機制與UTI抑制腫瘤細胞中uPA的表達有關。目前國內對于UTI在人卵巢癌治療方面的研究鮮有報道，為了研究證實UTI是否對人卵巢癌細胞的遷移和侵襲有抑制作用及其機制是否與uPA有關，本實驗探討了UTI對人卵巢癌細胞遷移和侵襲能力的影響，以及對 uPA表達水平的影響，為進一步研究UTI對人卵巢癌的臨床輔助治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞及主要試劑 人卵巢癌細胞系HO-8910PM購買于中科院上海細胞庫；胎牛血清和RPIM-1640購自杭州四季青生物工程材料有限公司；0.25%的胰酶購于美國GBICO公司；Matrigel購自美國BD公司；UTI購于廣東天普生化醫藥股份有限公司；AMV Reverse Transcriptase 購自美國Promega公司；DreamTaqTMGreen PCR Master Mix購自Fermentas公司；DNA MarkerⅠ購自日本TaKaRa公司；β-actin 單克隆抗體購自美國Sigma公司；HaltTMProtease Inhibitor Cocktail蛋白酶抑制劑、M-PER?Mammalian Protein Extraction Reagent和uPA抗體購自美國Thermo公司，HRP偶聯二抗購自美國Millipore公司；BCA Assay Reagent Kit、化學發光(ECL)試劑盒購自美國Pierce Chemical公司；其他常用試劑均為國產分析純試劑。

1.1.2引物 引物用Primer Premier 5.0軟件設計并經BLAST比對以后委托北京華大公司合成。uPA上游引物：5′-ACT CCA AAG GCAGCA ATG AA-3′，下游引物為：5′- AGA GTC TTT TGG CCA CAC TG-3′，產物長度469 bp。GAPDH上游引物為：5′- TAT AAA TTG AGC CCG CAG CC-3′，下游引物為：5′- ACA TGT AAA CCA TGT AGT TGA GGT-3′，產物長度244 bp。

1.2方法

1.2.1細胞培養 HO-8910PM細胞接種于含10%胎牛血清的RPIM-1640細胞培養液中，37 ℃恒溫、5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養，每2～3天換液。 實驗所用的細胞均為處于對數生長期的細胞。

1.2.2實驗分組及給藥 將處于對數生長期的HO-8910PM細胞分為對照組和UTI 低、中、高劑量組，對照組加入100 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)，UTI 低、中、高劑量組分別加入終濃度為400、800、1 600 U/mL UTI進行處理，處理后培養48 h再進行后續實驗。

1.2.3劃痕實驗 細胞按照前述分組及各組處理方式處理48 h后經0.25%胰酶消化，制成5×105個/mL的細胞懸液，向6孔板每孔中加入2 mL細胞后放置于 37 ℃含5%CO2、飽和濕度培養箱中過夜，次日取出后用200 μL的黃色槍頭于6孔板中劃痕，用無血清的RPIM-1640培養液沖洗后，于顯微鏡下觀察并拍照。培養48 h后，再次于顯微鏡下觀察并拍照，用Image J 軟件來測量劃痕區域的細胞遷移距離。

1.2.4Transwell侵襲實驗 Matrigel先用冰預冷的RPIM-1640培養基稀釋成為2.5 mg/mL，按每孔25 μL加入24孔板的Transwell小室上腔，置于4 ℃冰箱過夜，使Matrigel聚合成膠。次日取對數生長期的對照組及各處理組細胞，經0.25%胰酶消化后，離心并用RPIM-1640培養基調整細胞密度至2×106個/mL。上室接種100 μL不含血清的細胞懸液，下室加入500 μL含10%胎牛血清的1640完全培養基起趨化作用。每組設3個復孔，放置37 ℃恒溫、5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養 24 h后，棄上室液體，擦凈膜上未侵襲的細胞及Matrigel，經4%甲醛固定并用含 2%結晶紫的 2%乙醇染色，200倍光學顯微鏡下選擇濾膜上下左右中5個不同視野，計數每個視野侵襲細胞數。

1.2.5反轉錄PCR(RT-PCR)檢測細胞中uPA mRNA的表達 HO-8910PM細胞按照前述分組及各組處理方式加藥處理48 h后，按照TrizolTMReagent說明書進行總RNA抽提，-20 ℃保存備用。1%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠)100 V電泳15 min后凝膠成像系統檢測RNA質量，紫外分光光度計測定RNA濃度和純度。根據Promega公司反轉錄試劑盒說明書反轉錄合成cDNA，PCR反應體系為 20 μL，包括2×DreamTaqTMGreen PCR Master Mix 10 μL，cDNA 1.0 μL，上游引物(10 μmol/L)0.5 μL，下游引物(10 μmol/L)0.5 μL，添加去離子水使總體積達到20 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，32個循環；72 ℃最終延伸10 min。GAPDH作為內參。取適量PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統掃描拍照，Image J 軟件分析并計算目的基因uPA/GAPDH的灰度比值。

1.2.6Western blot檢測細胞uPA的表達 HO-8910PM細胞按照前述分組及各組處理方式加藥處理48 h后，迅速吸去培養液，并用冰預冷的PBS洗4次，每孔加入100 μL已加入HaltTMProtease Inhibitor Cocktail蛋白酶抑制劑的M-PER?Mammalian Protein Extraction Reagent，冰上放置30 min，間隔搖晃幾次；用乙醇處理過的細胞刮子將裂解的細胞刮下來，轉移至1.5 mL離心管。冰上超聲裂解細胞60 s，冰上放置15 min；1 300 r/min、4 ℃離心30 min，吸取上清至另一潔凈離心管中，分裝后保存于-80 ℃。提取的蛋白采用Pierce公司的BCA Protein Assay Reagent Kit進行定量。蛋白變性后取40 μg于12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上先80 V電泳1 h，再120 V電泳4 h，電泳結束后，用濕轉法將蛋白質轉移到以聚偏氟乙烯(PVDF)膜上；取下PVDF膜用麗春紅S染色，觀察轉膜效率。用含5%脫脂牛奶的-三乙醇胺緩沖鹽水(TBST)室溫封閉2 h；加入稀釋的一抗，4 ℃冷室中輕搖過夜，次日TBST洗3次，每次10 min；加入TBST稀釋的二抗，室溫孵育2 h，TBST洗3次，每次10 min；增強型ECL試劑盒進行ECL檢測，X光片壓片、顯影、定影。

A：顯微鏡下各組HO-8910PM細胞轉移能力(×100)；B：4組細胞遷移能力柱形圖a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與低劑量組比較；c：P<0.05，與中劑量組比較

圖1各組HO-8910PM細胞轉移能力比較

A：顯微鏡下各組HO-8910PM細胞侵襲能力(×200)；B：4組細胞侵襲能力柱形圖；a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與低劑量組比較；c：P<0.05，與中劑量組比較

圖2各組HO-8910PM細胞侵襲能力比較

2 結 果

2.1UTI對人卵巢癌細胞HO-8910PM轉移能力的影響 劃痕實驗結果顯示：與對照組相比，隨著UTI濃度增加，細胞遷移能力呈明顯減弱趨勢，各組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

2.2UTI對人卵巢癌細胞HO-8910PM侵襲能力的影響 HO-8910PM細胞經不同濃度UTI處理后行Transwell實驗，結果顯示：細胞經UTI處理后，穿過人工基底膜的細胞數明顯減少，侵襲能力受到明顯抑制，且呈濃度依賴，各組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.3UTI對uPA mRNA表達水平的影響 RT-PCR結果顯示：隨著UTI濃度的升高，uPA mRNA的相對表達水平逐漸降低，各組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

2.4UTI對uPA蛋白表達水平的影響 各處理組細胞uPA的蛋白表達水平較對照組明顯降低，隨著UTI濃度的升高，表達水平逐漸降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

1：對照組；2：低劑量組；3：中劑量組；4：高劑量組；A：PCR產物瓊脂糖電泳條帶；B：各組細胞uPA灰度值與GAPDH灰度值的比值柱形圖；a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與低劑量組比較；c：P<0.05，與中劑量組比較

圖3各組HO-8910PM細胞uPA mRNA表達水平比較

1：對照組；2：低劑量組；3：中劑量組；4：高劑量組；A：Western blot蛋白條帶；B：各組細胞uPA灰度值與β-actin灰度值的比值柱形圖；a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與低劑量組比較；c：P<0.05，與中劑量組比較

圖4各組HO-8910PM細胞uPA蛋白表達水平比較

3 討 論

卵巢癌之所以是死亡率最高的婦科腫瘤，其最主要的原因就是其轉移和復發率高。目前，傳統的根治性手術聯合輔助性化療仍是臨床上治療卵巢癌的基本方法[5]。但由于高轉移率及化療的毒副反應，患者的生存率并沒有提高。因此，探索卵巢癌侵襲轉移的機制，從而有效地控制卵巢癌細胞轉移，找到一種既能抑制卵巢癌細胞轉移，又安全有效的藥物，對改善卵巢癌患者的預后，提高其生存率具有重要的臨床意義[6]。

近年來，uPA系統在腫瘤轉移中的作用成為科學家們研究的熱點，已有大量實驗證實在乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、肺癌、口腔癌、結腸癌和前列腺癌等惡性腫瘤及其轉移瘤中uPA的表達水平均比正常組織和良性腫瘤細胞要高[7]。uPA在卵巢癌的轉移中也發揮著至關重要的作用，鄒存華等[8]對卵巢癌HO-8910PM細胞的研究結果顯示uPA所激活的纖溶系統在卵巢癌發生、發展過程中起重要作用。ZHANG等[9]的研究結果發現，卵巢癌中uPA的陽性率和血清學濃度均明顯高于卵巢良性腫瘤和正常卵巢組織，uPA的表達和卵巢癌的病理分期和遠處轉移具有相關性。KONECNY等[10]對卵巢癌的研究表明，uPA的表達水平可以作為判斷卵巢癌預后的獨立因子，uPA低表達患者的腫瘤無進展生存期和5年生存率高于高表達患者。本研究中檢測到HO-8910PM細胞侵襲能力與細胞中uPA mRNA表達水平和uPA蛋白表達水平呈正相關，通過抑制細胞中uPA mRNA和uPA蛋白表達水平可以明顯抑制細胞的侵襲轉移能力，這進一步證實uPA在卵巢癌的侵襲轉移中發揮著重要作用。

在深入探討uPA對卵巢癌侵襲轉移作用的同時，課題組也在思考能否通過抑制uPA表達從而達到抑制卵巢癌轉移的目的。本實驗中用到的UTI就是一種新型的uPA抑制劑。UTI一種從人類尿液中分離純化的尿胰蛋白酶抑制劑，能有效地抑制多種蛋白酶的活化，已被廣泛應用于彌散性血管內凝血、休克和和胰腺炎等炎癥性疾病的治療。UTI還具有抗腫瘤的作用，已有研究證實其對乳腺癌、人口腔表皮樣癌、結腸癌等多種腫瘤細胞具有明顯的抑制遷移和侵襲的能力。目前國內外多個課題組認為其機制與UTI抑制腫瘤細胞中uPA的表達有關。楊超文等[11]對體外肝癌細胞的研究中發現，當UTI的濃度達到600 U/mL時，肝癌細胞SK-HEP-1細胞中uPA的mRNA和蛋白表達均減少，且隨UTI濃度增加到900 U/mL時，uPA可能即是UTI作用的直接靶點或其下游靶點，從而發揮抑制肝癌細胞遷移和轉移的作用。本文作者曾對高轉移性絨毛膜癌細胞體外研究也顯示uPA的表達水平與絨毛膜癌細胞的體外侵襲轉移密切相關，且UTI 可以通過降低uPA的表達水平從而有效抑制絨毛膜癌細胞的轉移[12]。KOBAYASHI等[13]對卵巢癌的研究中發現UTI的N-末端是UTI與腫瘤細胞結合位點，其C-末端則是抑制腫瘤轉移的部位。然而，UTI抑制腫瘤細胞轉移和侵襲的機制及UTI作用的靶點卻仍不明確。鑒于國內對于UTI在人卵巢癌治療方面的研究鮮有報道，本實驗以高轉移人卵巢癌細胞HO-8910PM為研究對象，以證實UTI是否對人卵巢癌細胞的侵襲轉移有抑制作用及其機制是否與uPA有關。

本實驗中，劃痕實驗結果顯示UTI能夠有效地抑制 HO-8910PM細胞的轉移，且與UTI的濃度相關；預鋪Matrigel的Transwell小室充分模擬了天然基底膜結構，侵襲實驗結果顯示UTI能明顯抑制HO-8910PM細胞的侵襲性，且抑制作用與UTI的濃度相關。為了進一步探討其轉移和侵襲的機制，本研究用RT-PCR和Western blot方法檢測了uPA的表達情況，隨著UTI濃度的逐漸增加，uPA的mRNA和蛋白表達水平均逐漸降低，呈劑量依賴性，說明UTI 抑制卵巢癌細胞侵襲轉移可能是通過抑制細胞中uPA的mRNA和蛋白表達來實現的。

由于UTI來源于人體，抗原性小，對機體毒副反應小，不同于常規化療藥物，有開發為安全有效的抗腫瘤藥物的潛力，UTI有望通過下調卵巢癌細胞uPA的表達抑制卵巢癌的轉移，減少常規化療藥物的用量，緩解化療的毒副反應，改善預后。SONG等[14]對肝癌細胞的研究已經表明抗腫瘤藥物表柔比星聯合UTI應用可以明顯改善肝癌預后。而本研究應用UTI干預HO-8910PM細胞后，細胞中uPA的表達水平下降，且與UTI 劑量負相關，同時其遷移和侵襲能力也呈下降趨勢，由此推測其作用機制可能與UTI下調了與卵巢癌侵襲轉移密切相關的 uPA基因表達有關，為UTI用于卵巢癌輔助治療用藥提供了理論依據和可能性，但具體作用機制還需進一步研究。