基于磁性納米富集DNA及滾環擴增技術檢測PBMC內HBV cccDNA臨床價值分析*

王友強，郭永燦，蘭由玉，魏 聰，劉 鵬

(1.西南醫科大學中西醫結合學院，四川瀘州 646000；2.西南醫科大學附屬中醫醫院檢驗科，四川瀘州 646000；3.西南醫科大學附屬醫院風濕免疫科，四川瀘州 646000；4.西南醫科大學附屬中醫醫院肝病科，四川瀘州 646000)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染呈全球流行性趨勢，據統計全世界范圍內有近20億人曾經感染HBV，慢性HBV攜帶者超過2.5億[1]。我國是HBV感染最高發國家，目前有超過9 000萬慢性HBV攜帶者，乙型病毒性肝炎(簡稱乙肝)相關肝硬化、肝癌更是其死亡主要因素[2]。共價閉合環狀DNA(cccDNA)通過HBV病毒復制進入宿主細胞核，HBV cccDNA水平較低，但卻是HBV復制不可缺少的關鍵分子：它是HBV前基因組及RNA轉錄的原始模板[3]，可影響HBV對宿主的感染狀態，而清除細胞核HBV cccDNA是治愈HBV感染的標志。HBV主要在肝細胞內復制，但對肝細胞之外的其他細胞也具有泛嗜性，單個核細胞是可以被HBV感染的免疫活細胞，有研究顯示在外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中能檢測出HBV DNA及HBV cccDNA[4]。但是細胞內HBV cccDNA含量低，要獲取高純度HBV cccDNA難度較大，本研究通過磁性納米富集技術及滾環擴增(rolling circle amplication，RCA)技術測定HBV cccDNA水平，以期構建HBV cccDNA高靈敏度檢測方法，并探討檢測PBMC中HBV cccDNA臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇西南醫科大學附屬醫院2016年1月至2018年1月收治的HBV感染者98例為HBV組，其中男62例，女36例，年齡(39.51±7.22)歲，急性HBV感染8例，慢性HBV感染59例，肝硬化23例，肝衰竭8例。診斷標準：所有納入病例均符合《病毒性肝炎防治方案》[5]。排除標準：(1)妊娠期婦女；(2)人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者；(3)甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒感染者；(4)需要抗病毒治療患者曾經使用阿德福韋酯片或恩替卡韋片治療無效者。同時選擇該院100例健康體檢者為對照組。所有納入研究者均知曉本研究目的、過程及意義，簽署知情同意書。本研究得到醫院倫理委員會支持。

1.2方法

1.2.1標本采集 血液標本：取患者空腹靜脈血肝素抗凝、乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝各5 mL，肝素抗凝血3 500 r/min離心5 min，取上層血清保存于-20 ℃冰箱，待測乙肝兩對半、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)及天冬氨酸氨基轉移酶(AST)。EDTA抗凝血用于提取PBMC。肝組織活檢：患者行B超引導下肝穿刺取活檢組織，經固定、脫水、包埋、切片等程序后以蘇木素-伊紅(HE)染色，由有經驗的病理學醫師獨立完成病理分級。

1.2.2HBV感染標志物測定 實時熒光定量PCR檢測血清HBV DNA(Applied Biosystems實時熒光定量PCR儀，Thermo公司，美國)，用全自動化學發光儀測定血清HBsAg、HBeAg水平(雅培I-2000)。均采用配套成品試劑盒，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.3HBV cccDNA測定

1.2.3.1PBMC提取 采用淋巴細胞分離液梯度離心提取PBMC，完成后以0.9%生理鹽水洗滌3次，留細胞沉淀，保存于-20 ℃冰箱待測。

1.2.3.2HBV cccDNA提取 首先構建針對HBV cccDNA的特異性探針磁性納米微球：(1)20 mL氯化鐵(FeCl3，1.0 mol/L)與5 mL氯化亞鐵(FeCl2，2.0 mol/L)溶液混合均勻加入到250 mL(0.7 mol/L) 的氨水溶液中，離心分離后所得的黑褐色沉淀以超純水洗至中性，干燥后得到磁性氯化鐵(Fe3O4)納米粒子；(2)以1∶1∶4比例均勻混合Triton X-100、正己醇和環己烷，加入前述方法制訂Fe3O4納米分子，及正硅酸乙酯、氨水(質量分數為28%～30%)，持續攪拌24 h后用丙酮破壞乳化，并在一定的外磁場下收集顆粒，即為硅殼磁性納米顆粒；(3)將鏈霉親和素溶液(2.5 mg/mL)加入到5 mg前述方法制訂的硅殼磁性納米顆粒中，在4 ℃下恒溫振蕩培育24 h，PBS緩沖液洗滌3次，用2%的戊二醛溶液固定納米顆粒表面的鏈霉親和素，再將生物素標記的針對HBV cccDNA特異序列探針通過與修飾在硅殼磁納米顆粒表面的親和素偶聯，即HBV cccDNA磁性納米顆粒。以基因組提取試劑盒(Thermo，美國)提取總PBMC內總DNA，嚴格按照試劑盒說明書進行，分光光度儀260/280吸光度值在1.6～2.0為合格DNA標本，將得到的總DNA用PSAD酶(Plasmid-SafeTMATP-Dependent DNase)酶切消化以除去非cccDNA，-80 ℃冰箱保存備用。利用構建成功HBV cccDNA功能化納米顆粒富集、分離HBV cccDNA，詳細操作參照文獻[6]。

1.2.3.3HBV cccDNA檢測 RCA：以HBV高度保守區域分別設計8條與HBV cccDNA正鏈、負鏈互補的引物(上海生工)，序列見表1。RCA反應體系：10×Phi29 DNA聚合酶Buffer 1 μL、引物(R1-R81) 4 μL、DNA 4 μL、ddH2O補足1 μL，總體積：10 μL，經95 ℃ 3 min、50 ℃ 15 s、30 ℃ 15 s、20 ℃ 10 min反應后，再向混合液加入Phi29 DNA聚合酶1 μL(10 U/μL)、10×Phi29 DNA聚合酶Buffer 1 μL、引物(R1-R81) 4 μL、BSA 1 μL(0.4 mg/mL)、4×dNTP混合物3 μL，總體積：20 μL，30 ℃水浴16 h，65 ℃水浴10 min，保留RCA產物。以RCA產物為模板，進行跨缺口引物介導的實時熒光定量PCR反應，引物Prime1：5′-GGG GCG CAC CTC TCT TTA-3′，Prime2：5′-AGG CAC AGC TTG GAG GC-3′，具體操作參照文獻[7]。

1.2.3.4標準曲線 選擇1×104、1×105、1×106、1×107copies/mL濃度梯度標準品作標準曲線，判斷該方法敏感性。

1.3統計學處理 采用SPSS13.0軟件進行統計學分析，首先對數據進行正態性分布檢驗。計數資料采用χ2檢驗。非正態分布計數資料以中位數描述，采用Wilcoxon符號秩和檢驗。HBV cccDNA與感染指標采用Spearman秩相關性分析。采用受試者工作特征曲線(ROC)分析HBV cccDNA對抗病毒治療效果進行預測。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1方法學分析 采用1×104、1×105、1×106、1×107copies/mL濃度梯度標準品做標準曲線分析顯示：擴增曲線平行性好、濃度梯度拐點明顯、無交叉現象，曲線斜率穩定，敏感性較高?；颊逪BV cccDNA擴增曲線顯示：陽性標本、陰性標本曲線清晰，均為典型擴增曲線，無非特異性擴增曲線，不同濃度階段曲線分界清楚，見圖1。

2.2HBV cccDNA陽性率 98例HBV感染患者中HBV cccDNA陽性61例(62.24%)，對照組中HBV cccDNA陽性0例。HBV感染不同病情階段HBV cccDNA陽性率比較差異有統計學意義(P=0.00)，HBV感染伴肝衰竭、HBV感染伴肝硬化患者HBV cccDNA陽性率明顯高于急性HBV、慢性HBV感染，其中HBV感染伴肝衰竭陽性率最高，達到100%(P<0.05)；急性HBV、慢性HBV感染間HBV cccDNA陽性率比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

*：堿基硫化

A：標準品擴增曲線；B：標準品斜率；C：標本擴增曲線

圖1擴增曲線

2.3不同病理分期及HBV DNA水平患者HBV cccDNA水平比較 經病理活檢進行組織炎癥活動度分級、纖維化分期，34例患者分期小于G2/S2期，64例患者分期在G2/S2或以上，≥G2/S2期患者HBV cccDNA水平(中位數：5.8 lg copies/mL)明顯高于小于G2/S2期患者(中位數：3.7 lg copies/mL)，兩組比較差異有統計學意義(Z=4.378，P=0.001)。將HBV患者按照HBV DNA水平進行分組，≥1×105copies/mL患者HBV cccDNA水平(中位數：6.2 lg copies/mL)明顯高于小于1×105copies/mL患者(中位數：4.1 lg copies/mL)，兩組比較差異有統計學意義(Z=4.102，P=0.001)，見圖2。

表2 不同HBV感染階段HBV cccDNA陽性率比較[n(%)]

a：P<0.05，與急性HBV比較；b：P<0.05,與慢性HBV比較

2.4HBV cccDNA與感染指標相關性分析 HBV患者PBMC內HBV cccDNA水平與血清HBV DNA呈明顯正相關性(r=0.437，P=0.000)，見圖3A。HBV cccDNA與血清感染性指標相關性分析顯示，PBMC內HBV cccDNA水平與HBsAg呈明顯正相關性(r=0.338，P=0.001)，見圖3B；98例患者中有35例患者HBeAg陽性，HBeAg陽性患者PBMC內HBV cccDNA水平與HBeAg水平呈明顯正相關性(r=0.521，P=0.001)，見圖3C。

圖2 不同病理分期及HBV DNA水平患者

圖3 PBMC內HBV cccDNA與感染指標相關性分析

圖4 PBMC內HBV cccDNA對抗病毒治療效果ROC曲線

2.5PBMC內HBV cccDNA對抗病毒治療效果ROC曲線分析 共有40例患者需要抗病毒治療，以HBV患者抗病毒治療后出現病毒應答為標準，分析HBV cccDNA對抗病毒治療效果判斷價值。在抗病毒治療12周時PBMC內HBV cccDNA量對病毒應答無明顯預測作用，ROC曲線下面積(AUC)為0.608(95%CI：0.415～0.800)，P=0.268。在抗病毒治療24、48周時PBMC內HBV cccDNA量可對病毒應答明顯預測，AUC分別為0.771(95%CI：0.625～0.917)，P=0.005，0.868(95%CI：0.767～0.969)，P=0.000。ROC分析提示，在治療48周時HBV cccDNA為3.2 lg copies/mL時可作為預測出現病毒應答效應的截斷面，約登指數達到最大，見圖4。

3 討 論

HBV cccDNA無論在肝臟組織或其他感染細胞內均以較低水平存在，但是其可通過HBV前基因組及RNA轉錄來調控HBV病毒在宿主內復制。HBV cccDNA的清除預示著病毒在體內生命周期終結，有研究認為清除細胞核HBV cccDNA是治愈HBV感染的標志[3]。在HBV感染、病情監測及治療相關指標中，單純檢測HBV DNA對臨床分析具有局限性，而HBV cccDNA水平測定可彌補不足，二者綜合分析會更真實反映宿主體內HBV復制及感染狀態，能夠為臨床提供可靠的治療依據[8]。PBMC是免疫活細胞，HBV患者出現免疫抵抗能力下降可能與病毒在PBMC內長期復制而導致的免疫功能紊亂有關[9]。HBV持續慢性感染PBMC可能參與母嬰垂直傳播、肝移植后HBV復發等[10]。PBMC內HBV cccDNA水平與宿主肝臟組織HBV感染、復制情況具有一致性[11]，但HBV cccDNA在PBMC內水平較低，受限于檢測方法的靈敏度與特異度，目前尚不能作臨床常規檢測。

國內外學者已建立多種HBV cccDNA檢測方法，由于細胞內水平低難以獲得高純度cccDNA，以及與cccDNA具有同源序列的雙鏈DNA(rcDNA)干擾，這些檢測方法都難以獲得理想的靈敏度[12]。磁性納米富集技術利用磁性微粒表面功能化基團特異親和功能，可特異性地實現互補目標單鏈核苷酸片段的高效快速富集分離，本課題組在前期已經完成該方法特異性納米顆粒的制備，其性能得到驗證[7]。RCA具有很強擴增能力，在單核苷酸多態性、細胞原位分析等微量核酸測定有廣泛應用[13]，與傳統PCR比較，RCA只能在特異性聚合酶作用下擴增環狀DNA模板，可有效避免rcDNA對cccDNA擴增的影響。本研究選擇磁性納米富集聯合RCA技術來測定PBMC內HBV cccDNA，其擴增曲線清晰、典型，具有穩定的斜率、平行性。

本研究納入98例HBV感染患者，HBV cccDNA陽性率隨著病情進展其陽性率也隨之增加，肝硬化、肝衰竭患者PBMC內HBV cccDNA陽性率明顯升高(P<0.05)。而高HBV DNA載量患者PBMC內HBV cccDNA拷貝數明顯高于低HBV DNA載量患者，HBV DNA也與HBV cccDNA呈明顯正相關性(r=0.437,P=0.000)，表明HBV DNA復制可能依賴HBV cccDNA，其水平可在一定程度上反映HBV cccDNA存在情況。肝臟組織病理分期是判斷疾病進展的重要依據?！軬2/S2期患者PBMC內HBV cccDNA拷貝數明顯高于小于G2/S2期以下患者(Z=4.378,P=0.001)，提示HBV cccDNA在宿主體內持續存在可能導致疾病進展。HBV cccDNA是HBV DNA復制模板，HBV cccDNA本身不會引起肝組織損傷，但是其通過上調HBV DNA復制增加宿主體內病毒載量，以此激發免疫系統對HBV感染肝細胞進行攻擊導致肝臟組織受損，而作為免疫活細胞的PBMC感染HBV可能會加重這種病理應答[14]。

HBsAg、HBeAg是HBV DNA轉錄mRNA翻譯合成的HBV特異性病毒蛋白，其轉錄、調控及清除機制復雜，HBV cccDNA在此過程中如何發揮作用目前尚未完全闡明[15-16]。本研究結果顯示，PBMC內HBV cccDNA與血清HBsAg呈明顯正相關(r=0.338,P=0.001)，提示PBMC內HBV cccDNA可能會影響HBV表達。有學者認為以血清HBsAg衡量肝組織內HBV cccDNA還需考慮HBeAg狀態，本研究發現HBeAg陽性患者HBeAg與PBMC內HBV cccDNA存在明顯正相關性(r=0.521,P=0.001)。HBeAg陽性是HBV復制活躍標志，HBV cccDNA在細胞內活動度增加可能會優先上調HBeAg水平[17]。但是HBeAg陰性并不能表示HBV cccDNA或HBV DNA處于非活動狀態，因為部分患者存在HBV病毒前C區變異，HBeAg表達受限或不能表達。PBMC作為免疫活細胞，具有豐富的免疫信號傳導通路，能夠將細胞核內HBV cccDNA遺傳信息進行有效輸出，影響HBsAg、HBeAg等特異性蛋白表達。

HBsAg陰轉被認為是治療HBV感染的最理想狀態，但在實際抗病毒治療中出現HBsAg完全陰轉的病例非常少見，這可能與少量HBV cccDNA能夠穩定存在感染細胞內且不易受藥物影響有一定關系。細胞內cccDNA是慢性HBV持續感染的最主要原因，并且與抗病毒治療后復發相關，清除HBV cccDNA也被認為是治療HBV的根本途徑。本研究進一步分析PBMC內HBV cccDNA對HBV抗病毒治療效果判斷價值，結果顯示在抗病毒治療24、48周時PBMC內HBV cccDNA水平可對病毒應答進行判斷，在48周時具有最佳判斷效果，表明PBMC內HBV cccDNA可以用于評價抗病毒治療效果，在治療過程中可將其作為常規監測指標，進一步凸顯PBMC內HBV cccDNA檢測的臨床意義。

綜上所述，本研究證實HBV可感染PBMC，利用磁性納米富集及RCA可檢測PBMC內HBV cccDNA。PBMC內HBV cccDNA與HBV疾病進展有一定關系，也與血清HBV DNA、HBsAg、HBeAg水平相關，可作為抗病毒治療效果判定指標，對HBV患者檢測PBMC內HBV cccDNA具有重要臨床意義。