癌源外泌體的制備及其對胃癌細胞STK15表達的影響*

楊 勇,陳 霖,楊宏新,李 磊,于 建,何源哈達,楊 晨,徐 偉，高艷偉，高維實

(1.內蒙古自治區人民醫院腫瘤外科，呼和浩特 010017;2.內蒙古醫科大學基礎醫學院，呼和浩特 010059;3.湖北省宜昌市第一人民醫院中醫科 443000；4.內蒙古醫科大學臨床醫學院，呼和浩特 010059；5.內蒙古自治區人民醫院中西醫科，呼和浩特 010017)

隨著分子生物學和免疫學的發展，腫瘤的生物治療成為國際研究的熱點。近幾年具有亞細胞結構的外泌體(exosomes)日益受到重視，有學者預言外泌體可能會成為未來疾病診斷和治療的工具[1]。外泌體源自細胞并通過胞吐方式分泌到細胞外，是具有膜性結構的小囊泡[2]，來源于不同細胞的外泌體所含成分也不同，目前已證實很多類型細胞都能釋放外泌體，但外泌體負載的抗原物質存在很大差異，所以對不同來源的外泌體的深入研究對于腫瘤的個性化治療顯得非常重要[3]。絲氨酸/蘇氨酸激酶15(serine/threonine kinase 15，STK15)是中心體擴增相關基因，與細胞有絲分裂相關，有學者把其作為中心體擴增的標記物。早期有學者認為外泌體有抗腫瘤作用，有人推測其可能會成為抗腫瘤疫苗[4]，但隨研究的深入，有學者發現其負載腫瘤抗原有促進腫瘤細胞增殖作用[5-6]，故本研究以胃癌MGC-803細胞為模型，從其培養上清液中制備胃癌細胞分泌的外泌體，然后通過體外實驗證明外泌體對胃癌細胞的作用，以及對胃癌細胞產生效應的可能機制，為今后外泌體腫瘤疫苗研發提供理論依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 人低分化胃癌細胞株MGC-803為本實驗室常規傳代保存。RPMI 1640培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司，甲基偶氮唑藍(MTT)購自美國Sigma公司，二辛可寧酸(BCA)法蛋白定量試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司，STK15一抗購自美國GeneTex公司，鏈霉卵白素-過氧化物酶(S-P)檢測試劑盒和二氨基聯苯胺(DAB)顯示試劑盒及多聚賴氨酸購自福建邁新試劑公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 胃癌MGC-803細胞液氮取出復蘇后，置于含10%滅活胎牛血清、100 U/mL雙抗(青霉素和鏈霉素)的RPMI 1640培養液中，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內培養，0.25%胰酶消化液消化傳代，平均3～4 d傳代1次，所有實驗均采用對數生長期的細胞。

1.2.2外泌體的制備及蛋白定量 胃癌MGC-803細胞用75 mL培養瓶培養至對數生長期后，除去含血清培養基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3遍，隨后加入不含血清的RPMI 1640培養基，培養24 h后收集上清制備外泌體。(1)收集的上清液1 500 r/min離心10 min，3 500 r/min離心10 min;(2)采用15 000 r/min離心30 min，去除細胞及細胞碎片等物；(3)50 000 r/min離心2 h，用無菌PBS液稀釋沉淀物、采用濾器除菌(0.22 μm)。首先采用BCA法用標準品測定得到蛋白標準曲線，然后根據標準曲線測得外泌體蛋白水平。將沉淀物分裝在小離心管中，取出部分外泌體進行電鏡檢測，其余小管-80 ℃冰箱保存備用。

1.2.3電鏡鑒定外泌體結構 將20 μL外泌體懸液滴加在載樣銅網上，室溫條件靜置1 min后將銅網上多余液體用濾紙從側面吸干，在銅網上滴加pH值為6.8的磷鎢酸溶液(3%)30 μL，1 min后將磷鎢酸用濾紙吸干，室溫靜置10 min后在透射電鏡下觀察外泌體并照像。

1.2.4胃癌細胞增殖活力檢測 將對數生長期的MGC-803細胞用常規胰酶消化，PBS洗滌后再制成單細胞懸液，采用96孔板進行細胞培養，每孔接種100 μL細胞懸液(1×104個/mL)，培養12 h后，分別加入終濃度為0.05、0.10、0.20、0.50 μg/μL的外泌體。實驗設置實驗對照組及空白對照組，每組設8個復孔，每孔終體積為180 μL。培養12、24、36、48 h后，每孔加入MTT溶液(5 g/L) 20 μL，孵育4 h后吸棄上清，然后加入200 μL二甲基亞砜(DMSO)，充分混勻。570 nm波長條件下用酶標儀測定各孔平均吸光度值。

1.2.5細胞增殖相關基因STK15表達變化 將包被多聚賴氨酸蓋玻片置于6孔培養板中，培養12 h待細胞貼壁后加入濃度為0、0.20、0.50 μg/μL的外泌體。培養24 h后將蓋玻片取出放置于丙酮液中固定15 min，蒸餾水洗滌后，滴加3%的過氧化氫10 min，PBS洗滌，滴加血清封閉液10 min，滴加STK15一抗(1∶100)，4 ℃冰箱過夜，PBS代替一抗作為陰性對照。次日PBS洗滌，滴加生物素標記的二抗工作液10 min，PBS洗滌，滴加鏈霉素抗生物素蛋白過氧化酶10 min，PBS洗滌，滴加DAB顯色液5 min，自來水沖洗，蘇木精復染，鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察染色結果。采用彩色圖像分析系統測量陽性反應物的灰度值，在40倍視野下每張片子隨機測量4個視野取其平均值代表STK15染色強度。

2 結 果

2.1外泌體的制備和蛋白定量 胃癌MGC-803細胞按照上述方法經超速梯度離心后得到外泌體，經標準品測定得到標準曲線為Y=0.653 4X-0.005 8，測得制備的外泌體濃度為13.39 μg/μL。

圖1 倒置顯微鏡下胃癌MGC-803細胞(×200)

2.2外泌體的形態學鑒定 光學顯微鏡下可以看到胃癌細胞呈現梭形、多角形(圖1)，通過超速梯度離心法從胃癌MGC-803細胞上清液中得到外泌體，在透射電鏡下觀察到外泌體呈現圓形或橢圓形小囊泡，具有特征性的盤狀結構，有完整的包膜，內為低電子密度物質，直徑為50～130 nm，見圖2。

2.3外泌體對MGC-803細胞活力的影響 制備的外泌體與胃癌MGC-803細胞共培養，經MTT結果顯示外泌體隨著濃度從0.05、0.10、0.20、0.50 μg/μL升高，570 nm波長平均吸光度值升高，隨著時間延長吸光度值亦升高，通過方差齊性檢驗和方差分析后證實各時間節點的組間增殖活性差異有統計學意義(P<0.05)，外泌體以時間和劑量依賴性方式促進胃癌MGC-803細胞增殖，見表1。

圖2 透射電鏡下的外泌體(×15 000)

a:P<0.05，與0 μg/μL外泌體組比較；b：P<0.05，與0.50 μg/μL外泌體組比較

A:0 μg/μL外泌體組;B:0.20 μg/μL外泌體組;C:0.50 μg/μL外泌體組

圖3 MGC-803細胞0、0.20、0.50 μg/μL外泌體組中STK15基因表達(×400)

2.4免疫組織化學檢測結果 免疫組織化學染色結果顯示，STK15蛋白陽性反應物主要定位于細胞核，部分細胞質也有表達，陽性產物呈棕黃色顆粒，0.50 μg/μL外泌體的STK5表達高于0.20 μg/μL外泌體組，0.20 μg/μL外泌體組STK15表達高于MGC803細胞組，各組間表達強度差異有統計學意義(P<0.05)。0、0.20、0.50 μg/μL外泌體組中STK15基因表達，見圖3。

3 討 論

外泌體作為一種膜性小泡，最初是用來描述由網織紅細胞分泌的小囊泡，直徑為30～100 nm，呈現扁球體狀，外膜為磷脂雙分子層，在囊泡表面負載豐富的膜性分子，這些膜性分子與其功能和來源相關[7]。目前認為外泌體是由細胞膜內陷形成早期內體，早期內體的界膜向內凹陷出芽形成許多小泡，稱之為多泡體(multivesicular bodies，MVB)，當MVB膜與細胞膜融合后，再形成小泡被釋放至細胞外空間，這種小泡被稱之為外泌體。外泌體的膜也是由磷脂雙分子層組成，由于脂類分子可以進行不間斷運動，這樣外泌體可與具有膜性結構的物質不斷融合來交換物質，蘊含的生物信息逐漸被接觸的細胞所容納。目前人們知道，細胞之間的信息傳遞過程非常復雜，許多細節需要詮釋，誰來扮演細胞之間的“信使”是目前這個領域亟待需要解決的難題。外泌體小泡表面負載活性物質很多[8]，腫瘤細胞源的外泌體，負載信息更多[2]，作用更為復雜[9-10]。甚至有學者認為，不同類型腫瘤細胞共表達的腫瘤共同抗原可能就存在于外泌體囊泡上，外泌體可能以自分泌和旁分泌形式影響癌細胞和正常細胞之間的信息傳遞[11]。通過外泌體載體傳遞抗原給抗原呈遞細胞(如樹突狀細胞)，介導CD4+T細胞免疫反應來治療同基因源性和異基因源性腫瘤顯示巨大潛力。

有效、安全、穩定和實用是腫瘤理想的治療性疫苗應該具備的基本特征。從目前研究結果看腫瘤源外泌體具有膜的結構特征，大小只有100 nm左右，甚至更小，負載了腫瘤細胞的特征分子，具有納米疫苗的特征，可以作為一種新型的亞細胞疫苗，當然其免疫原性、安全性、免疫反應性、耐受性等需要在實驗中進一步驗證。腫瘤源外泌體疫苗，由于其負載腫瘤相關抗原多，與細胞膜有特殊的可融合性，在細胞間的信息傳遞過程中發揮巨大作用，而作為腫瘤疫苗與其他腫瘤肽疫苗、核酸疫苗相比，從理論上可激發的免疫反應更強烈，甚至在上述疫苗無效的情況下也可能誘導明顯的免疫應答。早期有研究報道當接種L1210細胞分泌的外泌體，移植性腫瘤細胞的生長可部分被抑制；抗腫瘤的T細胞免疫應答反應可被來自熱休克淋巴瘤細胞的外泌體誘導[12]。王東關等[13]發現，樹突狀淋巴細胞可被腫瘤源外泌體活化成為特異性的細胞毒性T細胞(CTL)，來殺傷腫瘤細胞。隨著現代生物科學的發展，人們采用CRISPR/Cas9技術對腫瘤細胞的基因編輯工作更為簡單，而外泌體作為細胞分泌的小泡，應該負載基因編輯后腫瘤細胞的特殊抗原，所以外泌體作為免疫調控和腫瘤治療的工具或藥物載體顯示巨大潛力[1,14-15]。本研究采用超速離心法制備的腫瘤細胞外泌體，經電鏡證實具有外泌體的特征。將制備外泌體作用于胃癌MGC803細胞，發現其可促進胃癌細胞生長，而且隨外泌體濃度增加對胃癌細胞的增殖作用也增強，同時隨著時間延長胃癌細胞增殖活性也越強，腫瘤源外泌體對胃癌細胞的生長作用具有時間和濃度依賴性。研究結果提示外泌體負載重要腫瘤抗原，由其傳遞給抗原呈遞細胞產生的免疫效應可能非常強烈。

STK15基因編碼一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，是中心體擴增相關激酶，其定位于中心體，位于染色體周圍，是細胞增殖過程的關鍵基因[16],在細胞周期的G1/S期開始出現。中心體作為細胞主要微管組織中心，在細胞有絲分裂期可形成兩極紡錘體，STK15不僅參與中心體的復制、分離和成熟，而且還參與紡錘體兩極的組裝與穩定性維持。當細胞周期結束后STK15迅速通過泛素化降解途徑降解，STK15的精確適時表達在細胞有絲分裂中起重要作用。當正常細胞STK15表達不容易檢測到，但細胞癌變后STK15高表達，結果導致多級紡錘絲形成，染色體不均等分離，遺傳物質不穩定，出現腫瘤惡性特征。有研究結果證實STK15可以轉化NTKT3細胞，使免疫缺陷裸鼠體內形成腫瘤，STK15是細胞增殖過程的重要標志。本研究發現胃癌MGC803細胞STK15有少量表達，加入0.20 μg/μL和0.50 μg/μL濃度的外泌體后，其表達水平逐漸增高(P<0.05)，而細胞增殖活性也逐步提高(P<0.05)，胃癌源外泌體攜帶抗原成分可使胃癌細胞的STK15基因過表達，從而加速腫瘤細胞增殖分裂。研究也提示制備的外泌體充當了“信使”，通過膜分子的相互作用將中心體復制相關蛋白傳遞給胃癌細胞，導致胃癌細胞增殖加速。

外泌體最近已經成為癌癥和其他疾病中潛在有希望的診斷和預后生物標志物[17]。本研究提示腫瘤源的外泌體或經基因修飾后的外泌體可能在腫瘤免疫治療方面具有更大的生機。有研究表明，在免疫應答下調或誘導免疫耐受過程中外泌體也在發揮作用，如外泌體通過誘導免疫耐受促進了腫瘤細胞的生長[18]，這給腫瘤治療提出新的挑戰，需要深入研究。