PPAR-α受體激動劑對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用*

楊旭堃,申 芹

(四川大學華西第四醫院重癥監護室，成都 610041)

肝臟部分切除在臨床上被廣泛用于治療肝臟外傷、肝臟腫瘤、肝臟內膽管結石等疾病。此外，肝移植還是目前治療終末期肝臟疾病惟一的有效治療方式。 肝臟缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury，HI/R)嚴重制約了肝移植及肝臟切除術的廣泛開展[1]。其發病機制復雜，目前尚未完全闡明。既往研究顯示，再灌注過程中引起的線粒體凋亡途徑廣泛激活是導致缺血再灌注損傷的重要因素[1]。過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor α,PPAR-α) 是由配體激活的在肝臟廣泛表達的核轉錄因子,可調控脂肪肝等多種肝臟疾病的發病過程，但對缺血再灌注損傷的作用尚不清楚[2]。為此，本實驗在成功構建大鼠HI/R模型的基礎上，觀察PPAR-α激動劑非諾貝特(fenofibrate,FEN)對HI/R的影響，并初步探討其在HI/R中的可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 40只健康雄性SPF級SD大鼠,體質量(220±30)g,購于四川大學華西醫院實驗動物中心。

1.1.2主要試劑 PPAR-α激活劑FEN購自北京京豐制藥有限公司，PPAR-α抑制劑GW6471購自天津彬馨博澳有限公司;水合氯醛購自武漢谷歌科技有限公司；沉默信息調節因子1(silence information regulator 1,SIRT1)、叉頭轉錄因子1(forkhead transcription factor1，FOXO1)、乙酰化FOXO1(Ace-FOXO1)、裂解型天冬氨酸蛋白水解酶(cleaved-caspase3,C-caspase3)和細胞質中細胞色素C(cytochrome C,CytC)、Bax均購自美國CST公司；β-actin購自美國Abgent公司；TUNEL 試劑盒購買于北京中生有限公司。

1.2方法

1.2.1動物分組及建模 根據OHMORI等[3]方法構建大鼠HI/R模型。按4 mg/kg的10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,取上腹部正中切口進入腹腔,充分暴露肝門部,利用無創血管夾鉗夾閉門靜脈和肝動脈分枝,誘發70%的熱缺血,60 min后松開血管鉗恢復肝臟血流即行再灌注,120 min肝臟再灌注完成后從門靜脈取血2～3 mL,并迅速切取缺血的肝組織,置于-80 ℃低溫冰箱保存，具體手術方式參照文獻[4]。將40只SD大鼠均分為對照組、模型組、PPAR-α激動劑FEN組(FEN組)和PPAR-α抑制劑GW6471組(GW組)，每組10只。FEN組術前1 h給予FEN腹腔注射(50 mg/kg)，GW組術前1 h給予FEN (50 mg/kg)+GW6471(3.5 mg/kg)腹腔注射,劑量參考文獻[5]。對照組和模型組則給予等量生理鹽水腹腔注射。模型組、FEN組和GW組行HI/R損傷，對照組操作同上，但不夾閉門靜脈和肝動脈分枝。

1.2.2標本檢測 在再灌注后2 h從門靜脈抽取靜脈血,利用全自動生化分析儀檢測血清中丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)和堿性磷酸酶(ALP)水平。收取各組肝臟標本,采用TUNEL法檢測肝臟細胞凋亡，利用蘇木精-尹紅(HE) 染色觀察各組肝臟組織病理形態。利用Western blot檢測SIRT1、FOXO1、Ace-FOXO1、C-caspase3和細胞質中CytC表達水平，具體方法參考文獻[6]。

2 結 果

2.1各組大鼠血清中ALT、AST和ALP水平比較 與對照組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST和ALP水平明顯升高(P<0.01);經FEN預處理，FEN組HI/R大鼠血清中ALT、AST 和ALP水平較模型組明顯降低(P<0.05)；而GW組與FEN組比較，HI/R大鼠血清中ALT、AST 和ALP水平明顯增高(P<0.05)，見圖1。

1：對照組；2：模型組；3：FEN組；4：GW組；a：P<0.01，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與FEN組比較

圖1各組大鼠血清中ALT、AST和ALP水平比較

2.2各組大鼠肝臟病理形態結構比較 對照組肝小葉結構完整清晰，模型組肝細胞大范圍出血壞死，匯管區大量炎癥細胞浸潤中央靜脈，與對照組比較，病理損傷明顯增加(P<0.05)；FEN組肝細胞水腫變性，未見壞死，散在空泡樣變，匯管區可見少量炎性細胞浸潤，與模型組比較，FEN組病理損傷明顯減輕(P<0.05) ；GW組可見肝細胞廣泛腫脹、空泡樣變、壞死，匯管區可見較多炎癥細胞浸潤，與FEN組比較，病理損傷明顯增加(P<0.05)，見圖2。

a：P<0.01，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與FEN組比較

圖2各組大鼠肝臟組織病理改變(HE，×200)

2.3各組大鼠肝臟TNUEL表達比較 與對照組比較,模型組TUNEL陽性表達率明顯增高(P<0.05)； FEN組與模型組相比，TUNEL陽性表達率明顯降低(P<0.05)；GW組與FEN組比較，TUNEL陽性表達率明顯增高(P<0.05)，見圖3。

a：P<0.01，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與FEN組比較

圖3各組大鼠肝臟細胞凋亡情況(TUNEL，×100)

2.4各組大鼠肝臟C-caspase3表達水平比較 Western blot檢測結果顯示，與對照組比較，模型組C-caspase3表達水平明顯增高(P<0.05)； FEN組與模型組比較，C-caspase3表達水平明顯降低(P<0.05)；與FEN組比較,GW組C-caspase3表達水平明顯增高(P<0.05)，見圖4。

2.5各組大鼠肝臟細胞質中CytC表達水平比較 Western blot檢測結果顯示:與對照組比較,模型組細胞質CytC表達水平明顯增高(P<0.05)； FEN組與模型組比較，細胞質CytC表達明顯降低(P<0.05)，與FEN組比較,GW組細胞質中CytC表達水平明顯增高(P<0.05)，見圖5。

a：P<0.01，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與FEN組比較

圖4各組大鼠肝臟C-caspase3蛋白表達水平比較

a：P<0.01，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與FEN組比較

圖5各組大鼠肝臟細胞質中CytC蛋白表達水平比較

2.6FEN對HI/R大鼠肝臟SIRT1/FOXO1信號通路的影響 Western blot檢測結果顯示，與對照組比較,模型組SIRT1蛋白表達水平明顯降低(P<0.05),而Ace-FOXO1蛋白表達水平明顯增高(P<0.05)，FOXO1表達差異無統計學意義(P>0.05)。與模型組比較,FEN組SIRT1蛋白表達水平明顯增高(P<0.05),而Ace-FOXO1蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，FOXO1表達差異無統計學意義(P>0.05)。與FEN組比較,GW組SIRT1蛋白表達水平明顯降低 (P<0.05),而Ace-FOXO1蛋白表達水平明顯增高(P<0.05)，FOXO1表達差異無統計學意義(P>0.05)。見圖6。

1：對照組；2：模型組；3：FEN組；4：GW組；a：P<0.01，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與FEN組比較

圖6各組大鼠SIRT1及Ace-FOXO1等蛋白

表達水平比較

3 討 論

缺血性肝損傷是臨床上常見的肝臟疾病之一，其誘發的肝臟功能受損乃至肝臟功能衰竭發生率較高[1-2]。肝臟缺血發生后，及時恢復缺血區肝臟血流是減少肝臟受損最有效的治療方案，但缺血肝組織恢復肝臟血流灌注后，伴隨大量活性氧產生，繼而導致肝臟細胞凋亡和壞死加重，這種臨床現象稱之為HI/R[1-2]。目前對HI/R的防治手段極其有限，因此，尋找有效治療藥物具有緊迫而重大的臨床現實意義。

FEN是PPAR-α激動劑之一，在臨床上廣泛用于降血脂[3]。研究顯示，PPAR-α激動劑FEN除具有降脂的活性外，還具有抗氧化、抗癌、抗炎及抗凋亡等多種生物學活性[3]。最近研究發現，PPAR-α激動劑對心、腸、腎等器官缺血損傷具有保護作用，但對HI/R的作用及機制尚不清楚[7]。此外，PPAR-α特異性阻斷劑，如GW6471可反轉PPAR-α激動劑對器官缺血損傷的保護作用[8]。因此本研究擬探討PPAR-α激動劑非諾貝特對HI/R的保護作用及其相關作用機制。

在OHMORI等[3]構建的經典HI/R模型中，HI/R可導致大鼠肝功嚴重受損和肝臟病理改變。本研究結果顯示HI/R可導致血清中急性肝損傷指標如ALT、AST和ALP表達水平增高及肝臟病理形態改變，與OHMORI等[3]的研究結果一致，提示本研究構建大鼠HI/R模型成功。而PPAR-α激動劑FEN預處理可明顯減少ALT、AST和ALP表達水平，而肝臟病理損傷及PPAR-α特異性阻斷劑GW6471可反轉FEN的上述作用，提示PPAR-α激動劑對HI/R保護作用，其作用機制與激活PPAR-α相關。

細胞凋亡是受基因嚴密控制的程序化細胞死亡，是細胞死亡的一種重要形式，是可反映機體器官受損的一個重要指標[9]。既往研究顯示，線粒體介導的肝臟細胞凋亡是HI/R的重要致病機制[1]。caspase9是線粒體凋亡途徑中的啟動子及重要關聯蛋白[10]。當線粒體凋亡途徑被缺血再灌注損傷激活時，位于線粒體中的CytC遷徙到細胞質，與線粒體凋亡誘導因子(AIF)等形成凋亡體。該凋亡體可與caspase9結合，在ATP的作用下，可促進caspase9轉化為活化的caspase9,然后活化的caspase9可呈級聯反應促進caspase3降解和C-caspase3表達增高,然后導致細胞凋亡[11]。因此C-caspase3、TUNEL及細胞質中CytC表達的高低可反映線粒體介導凋亡信號途徑的強弱。結果顯示，與GW組和模型組相比，FEN組C-caspase3、TUNEL及細胞質中CytC表達明顯降低，提示PPAR-α激動劑FEN可通過抑制線粒體凋亡信號途徑激活減輕HI/R。

SIRT1是一組蛋白脫乙酰化修飾酶，其活性主要依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，大量研究顯示其具有調節細胞代謝、分化、凋亡和抗衰老及減輕HI/R的重要作用，其轉錄底物包括FOXO1,p53和Ku70等[12]。本課題組既往研究顯示，其抗凋亡的信號途徑為促進轉錄因子FOXO1去乙酰化，繼而減少線粒體凋亡信號途徑的激活和細胞凋亡[12]。本研究結果顯示，與GW組和模型組相比，FEN組SIRT1表達增高，而Ace-FOXO1的表達降低。提示PPAR-α激動劑FEN可通過增加SIRT1的表達而減少FOXO1的乙酰化修飾，從而抑制線粒體凋亡途徑的激活。

綜上所述，PPAR-α激動劑FEN對HI/R具有保護作用，而SIRT1/FOXO1 信號通路抑制線粒體介導的凋亡信號途徑在其肝臟保護作用中起重要作用，該研究為臨床上應用PPAR-α激動劑治療缺血性肝損傷患者提供了新的理論依據。