2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝患者血漿miR-577水平與脂代謝及胰島素抵抗關系的研究

王 蕤,吳素萍,徐品穎

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院 臨床營養(yǎng)科，北京100029;2.首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院 檢驗科，北京100029)

二型糖尿病(diabetes mellitus,type 2或T2DM)占所有糖尿病患者的90%以上，多發(fā)病于35-40歲的成年患者[1]。非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)與T2DM存在明顯關聯性，臨床數據顯示，50%-75%的T2DM患者伴有NAFLD或血脂代謝異常，40-50%的NAFLD患者伴有不同程度的糖代謝異常[2]。文獻報道，T2MD合并NAFLD患者存在更為嚴重的胰島素抵抗和脂代謝紊亂，而高TG血癥、肥胖及ALT升高增加T2DM合并NAFLD的發(fā)生風險[3，4]。這些提示T2MD與NAFLD存在密切的相關聯系。微小RNA(MicroRNA，miR)屬于轉錄本長度在22-25nt范圍內的非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)，通過影響靶基因的轉錄和翻譯來調控細胞的生長，分化，增殖和凋亡[5]。研究報道，循環(huán)miRNA-126在不同階段T2DM患者中均呈低表達，而其表達下調可能與血管內皮功能障礙有關[6]。另有文獻報道，白藜蘆醇可通過上調miRNA-122表達、下調SPT蛋白表達而減少肝細胞中神經酰胺水平，從而治療非酒精性脂肪肝。提示，miRNA在T2MD和NAFLD中發(fā)揮著一定作用[7]。本研究觀察T2DM與T2DM合并NAFLD患者中的差異miRNA，分析其與T2DM合并NAFLD的風險關系，并探討其與胰島素抵抗和脂代謝的聯系，為臨床預防或治療T2DM合并NAFLD提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究經醫(yī)院倫理委員會批準后進行，所有患者均簽署知情同意書。選取2015年12月至2017年1月間在首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院就診的T2DM患者200例，其中男性152名，女性48名，平均年齡(40.3±15.8)歲，合并 NAFLD者104例，未合并 NAFLD 者96例，分別作為合并組(T2DM/ NAFLD)和對照組(T2DM)。T2DM按1999年WHO糖尿病診斷標準確診，根據病史排除1型糖尿病、妊娠期糖尿病及特殊類型糖尿病。NAFLD按2006年中華醫(yī)學會《非酒精性脂肪性肝病診療指南》確診，根據病史排除酒精、病毒及藥物性肝病引起的脂肪肝，同時排除系統(tǒng)性免疫功能疾病、腎臟心臟功能異常及惡性腫瘤等患者。

1.2 方法

1.2.1人體參數測量

所有患者測量身高、體重、腰圍、臀圍，計算體重指數(BMI)，BMI=體重/身高2(kg/m2)。

1.2.2血脂和血糖水平比較

患者禁食8-12 h，次日早晨抽取靜脈血，檢查空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(Fins)、餐后2 h血糖(2h PBG)、餐后2 h胰島素(2h Ins)、谷氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、谷氨酰轉肽酶(GGT)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、糖化血紅蛋白(HbAIc)等指標，計算胰島素抵抗指數(HomA-IR)，HomA-IR=FPG×Fins/22.5。

1.2.3RT-qPCR檢測各組患者血漿miR-577水平

按照200 μl血漿加入1 000 μl QIAzol裂解試劑(QIGEN，德國)分離血漿總RNA，室溫放置15 min，根據miRNeasy血清/血漿試劑盒(QIGEN，Germany)實驗方法提取RNA。使用15 μl DEPC水來溶解總RNA。由一步PrimeScript miRNA cDNA合成試劑盒(Takara，日本)如前所述分離RNA合成cDNA。PCR參數設置：37℃/60 min和85℃/5 s。RT-qPCR：用SYBR Premix Ex TaqTM II(TakaRa，日本)制備20 μl RT-qPCR系統(tǒng)，并使用ABI 7500熒光定量PCR儀器 (Applied Biosystems，美國)進行擴增。PCR參數設置：95℃/30 s，90℃/5 s，65℃/30 s 40個循環(huán)。以U6為內參，2(-△△CT)法計算miR-577的相對水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 T2DM/ NAFLD和T2DM組臨床特征比較

如表1所示，T2DM/ NAFLD和T2DM組年齡、性別、腰臀比及血壓均無統(tǒng)計學差異；與T2DM組相比較，T2DM/ NAFLD組BMI明顯升高(P<0.01)。

2.2 T2DM/ NAFLD和T2DM組生化指標比較

如表1所示，T2DM/ NAFLD和T2DM組TC、HDL-C及FBG差異無統(tǒng)計學意義；與T2DM組相比較，T2DM/ NAFLD組AST、ALT、TG、GGT、LDL-C、2hPBG、Fins、2h Ins、HbAIc(%)及HomA-IR均明顯升高(P<0.05或P<0.01)。

表1 T2DM/ NAFLD和T2DM組臨床特征及生化指標比較

2.3 T2DM/ NAFLD和T2DM組血漿miR-577水平比較

實時熒光定量PCR結果顯示，與T2DM組相比較，T2DM/ NAFLD組血漿miR-577水平明顯降低(P<0.01)，結果如圖1所示。

2.4 各臨床指標與T2DM/ NAFLD相關性分析

以T2DM是否合并NAFLD為因變量，以年齡、性別、腰臀比等臨床特征以及AST、ALT、TG等生化指標作為自變量，采用單因素logistic回歸分析，結果顯示BMI、ALT、GGT、LDL-C、2hPBG、2h Ins、HbAIc(%)、HomA-IR及miR-577與NAFLD的發(fā)生有關(P<0.05或P<0.01)；多因素logistic回歸分析結果顯示BMI、ALT、LDL-C、2h Ins、HomA-IR及miR-577是影響T2DM/NAFLD發(fā)生的獨立危險因素(P<0.05或P<0.01)，見表2。

圖1 T2DM/ NAFLD和T2DM組血漿miR-577水平比較

注：*P<0.01

2.5 血漿miR-577水平與T2DM/ NAFLD患者各臨床指標的相關性分析

Pearson法分析miR-577與T2DM/ NAFLD其他獨立危險因素的相關性，結果如圖2所示，miR-577與ALT(r=-0.589，P=0.012)，LDL-C(r=-0.788，P<0.001)，2h Ins(r=-0.695，P=0.002)，HomA-IR(r=-0.696，P= 0.001)呈負相關，與BMI不相關。

表2 各臨床指標與T2DM/ NAFLD相關性分析

圖2 T2DM/ NAFLD患者血漿miR-577水平與ALT，LDL-C，2h Ins，HomA-IR相關性分析

3 討論

miR-577作為miRNA的一種，參與了惡性腫瘤、骨關節(jié)炎及胰腺β細胞功能的調控[8-10]。文獻報道，miR-577可靶向作用于人成纖維細胞生長因21(FGF-21)，抑制FGF-21誘導的胰島細胞胰島素分泌[10]。Li[11]等也證實了miR-577對FGF-21存在靶向作用。FGF-21主要由肝臟和脂肪組織產生，其通過分泌入血對體內代謝過程進行調節(jié)，如糖脂代謝、膽固醇、膽汁酸合成及維生素代謝等[12]。這些提示，miR-577可能影響糖脂代謝、膽固醇、膽汁酸合成等生理活動。但目前還未有臨床研究報道m(xù)iR-577與T2DM合并NAFLD的關系。本研究通過分析T2DM組與T2DM合并NAFLD組患者臨床特征及血脂血糖生化指標差異，發(fā)現T2DM合并 NAFLD組患者BMI、AST、ALT、TG、GGT、LDL-C、2hPBG、Fins、2h Ins、HbAIc(%)及HomA-IR均明顯升高，血漿miR-577水平顯著降低。進一步分析數據發(fā)現BMI、ALT、LDL-C、2h Ins、HomA-IR及miR-577是影響T2DM合并 NAFLD發(fā)生的獨立危險因素。研究報道，BMI、TC、HomA-IR、FGF -21是影響NAFLD發(fā)生的獨立危險因素[13]。另有文獻顯示，TG、BMI、ALT是T2DM合并 NAFLD的主要危險因素[4]。本研究與文獻報道存在共性與聯系，同時也存在差異結果。這可能與樣本量及患者生活環(huán)境存在一定的關系。基礎研究顯示miR-577與FGF-21存在靶向性，而FGF -21是影響NAFLD發(fā)生的獨立危險因素[4,10]，提示miR-577可通過影響FGF-21的生物學效應進而影響NAFLD的發(fā)生。NAFLD患者為T2DM的高發(fā)人群[4]。這些將miR-577與T2DM合并 NAFLD相聯系，為本研究中“miR-577是T2DM合并 NAFLD發(fā)生的獨立危險因素”提供了理論支撐。

本研究中miR-577與BMI、ALT、LDL-C、2h Ins、HomA-IR均為T2DM合并 NAFLD發(fā)生的獨立危險因素。為了解miR-577與BMI、ALT、LDL-C、2h Ins、HomA-IR的關系，本研究采用Pearson法對上述指標進行了相關性分析，結果顯示miR-577與ALT、LDL-C、2h Ins、HomA-IR呈負相關，而與BMI不相關。在離體細胞實驗中，miR-577可抑制胰島β細胞分泌胰島素[10]。而本研究中T2DM合并 NAFLD組miR-577表達較T2DM組患者明顯降低，而HomA-IR和2h Ins顯著上升，這可能與miR-577對胰島β細胞分泌胰島素的抑制作用降低有關。HomA-IR是影響NAFLD發(fā)生的獨立危險因素[13]。提示，miR-577降低可能是T2DM人群發(fā)生NAFLD的影響因素。本研究中miR-577和ALT及LDL-C呈負相關，這直接提示miR-577與脂代謝有關。

綜上所述，血漿miR-577水平降低是T2DM發(fā)生NAFLD的獨立危險因素，miR-577可能通過影響ALT、LDL-C和胰島素分泌發(fā)揮作用。近年來，作為人類體內龐大的一類基因表達調控因子，miRNA的研究逐漸被科研工作者所重視。miRNA的功能涉及神經系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)及消化系統(tǒng)，參與機體生長發(fā)育、免疫調節(jié)、激素分泌等[14-17]。同時，miRNA在許多疾病中異常表達，而針對異常表達的miRNA采取相應的治療措施可能是控制疾病發(fā)展的有效方法。本研究中T2DM合并 NAFLD患者血漿miR-577水平顯著降低，針對miR-577表達或者功能調節(jié)有可能是治療T2DM合并 NAFLD的新方法。但本研究中miR-577的功能作用還未完全明了，有待于進一步探討。