特應(yīng)性皮炎患者外周血中Th22、Treg細(xì)胞及其細(xì)胞因子表達(dá)的研究

李 志，楊婷婷，李文哲

(1.大連市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科,遼寧 大連116033；2.大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,遼寧 大連116044)

特應(yīng)性皮炎(Atopic dermatitis，AD)是一種發(fā)病過程漫長且反復(fù)發(fā)作的皮膚病，在兒童期發(fā)病較高，呈上升趨勢，雖然治療的方法有很多[1]，但是由于其發(fā)病機(jī)制沒有全部弄清，并不能進(jìn)行特效治療，給患者帶來巨大的痛苦。因此對特應(yīng)性皮炎的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入的研究有著重大的意義。AD的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前普遍認(rèn)為本病是由先天免疫缺陷和后天環(huán)境因素相互作用引起的。而CD4+T細(xì)胞在AD的發(fā)病中所發(fā)揮重要的作用已得到普遍認(rèn)同。CD4+T細(xì)胞是一類功能復(fù)雜的細(xì)胞群，根據(jù)其所產(chǎn)生的細(xì)胞因子不同，可以分為多個亞群。傳統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)AD的發(fā)病機(jī)制與Th1/Th2細(xì)胞失衡有著密切的關(guān)系，近年來，多種CD4+T細(xì)胞亞群的發(fā)現(xiàn)更加完善了Th1/Th2細(xì)胞失衡理論。很多學(xué)者已經(jīng)通過大量的研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞22(Th22)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)等細(xì)胞均參與AD的病理過程并在其中扮演著非常重要的角色。皮膚中的Th22大多數(shù)是由樹突狀細(xì)胞和朗格漢斯細(xì)胞分化而來，其分泌的IL-22能夠破壞皮膚的屏障功能。Cosmi等發(fā)現(xiàn)[2]，Treg細(xì)胞就有抑制Th1和Th2的作用，并且對于Th2活性的抑制低于Th1。本研究主要通過檢測AD患者的外周血中Th22細(xì)胞和Treg細(xì)胞的比例以及血清IL-22、TGF-β的表達(dá)，并分析這些細(xì)胞及其細(xì)胞因子與AD嚴(yán)重程度之間的關(guān)系，從而進(jìn)一步的討論Th22細(xì)胞和Treg細(xì)胞在AD患者發(fā)病機(jī)制中的價值，以便于臨床采取更好的治療措施來控制患者的病情。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

選取2017年8月至2018年3月在大連市中心醫(yī)院就醫(yī)的特應(yīng)性皮炎患者52例初診病例作為患者組，這些患者的病情嚴(yán)重程度按照歐洲特應(yīng)性皮炎評分標(biāo)準(zhǔn)(SCORAD)進(jìn)行評分[3]，按分值從高到低分為3組，>50分為重度組，25-50分為中度組，0-25分為輕度組。其中輕度AD組20例，中度AD組18例，重度AD組14例。4組對象在性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。20例健康人為對照組。

1.2 主要試劑

FITC標(biāo)記-抗人CD4單克隆抗體(CD4-FITC)、IntraPrepTM固定劑以及破膜劑均購自美國Beck-Man公司；PE-IL-22，PE-Foxp3 單抗均購自美國eBioscience公司；淋巴細(xì)胞分離液、RPMI-1640培養(yǎng)基等均購自美國Sigma-Aldrich公司；人IL-22 ELISA試劑盒、人TGF-βELISA試劑盒，購自美國R&D公司。(2)主要儀器設(shè)備：流式細(xì)胞儀購自美國Beck-Man公司。

1.3 樣本采集和處理

采集受檢者在清晨空腹條件下的靜脈血各3 ml于EDTA抗凝管和促凝管中,EDTA抗凝管中的血用于Treg細(xì)胞的檢測以及用密度梯度離心法Ficoll分離單個核細(xì)胞(PBMCs)后對Th22細(xì)胞的檢測。促凝管中的血分離血清后，取上層血清置于-70℃的冰箱中保存用于ELISA檢測細(xì)胞因子IL-22和TGF-β的濃度。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1Th22細(xì)胞和Treg細(xì)胞的流式檢測

將分離后的外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)進(jìn)行兩次洗滌后重懸于RPMI-1640培養(yǎng)液中，然后將CD4-FITC單抗加入細(xì)胞懸液中進(jìn)行混勻后避光孵育20 min。再在標(biāo)記后的PBMCs中加入刺激培養(yǎng)液，使得細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106/ml，隨后置入培養(yǎng)箱孵育4 h后，用PBS洗滌兩次。再將洗滌后的細(xì)胞懸液采用IntraPrepTM試劑進(jìn)行固定和破膜，將破膜后的懸液再經(jīng)過兩次洗滌后平均分成2管，分別加入PE-IL-22和同型對照IgG1-PE各10 μl,再避光孵育30 min后洗滌兩次。最后,采用流式細(xì)胞儀測定已經(jīng)標(biāo)記細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

取外周全血200 μl加入CD4-FITC單抗，用于Treg細(xì)胞的標(biāo)記，將標(biāo)記后的全血樣本用PBS洗滌兩次后，用試劑ItraPrepTM 進(jìn)行固定和破膜。將破膜后的懸液再經(jīng)過兩次洗滌后平均分成2管，分別加入PE-Foxp3抗體和Foxp3對照抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的標(biāo)記,孵育30 min。最后,采用流式細(xì)胞儀測定已經(jīng)標(biāo)記細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

1.4.2ELISA檢測血清中IL-22和TGF-β濃度

將已經(jīng)分離好的上層血清取出后，用ELISA的方法檢測血清中細(xì)胞因子IL-22和TGF-β的濃度，在檢測時嚴(yán)格按照IL-22和TGF-β各自的ELISA試劑盒的操作說明進(jìn)行操作。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 外周血中Th22和Treg細(xì)胞的比例

與健康對照組相比，輕、中、重度特應(yīng)性皮炎患者外周血中Th22 細(xì)胞的比例均顯著增高(P<0.000 1)，Treg細(xì)胞的比例顯著降低(P<0.000 1)；與輕度、中度特應(yīng)性皮炎患者相比，重度特應(yīng)性皮炎患者外周血Th22 細(xì)胞的比例顯著增高(P<0.000 1)，Treg 細(xì)胞的比例顯著降低(P<0.000 1)，見表1。

表1 各組受試者外周血中Th22和Treg細(xì)胞表達(dá)比列

注：與健康對照組相比較，*P<0.0001，△P<0.0001，☆P<0.0001；與輕度、中度AD患者相比較★P<0.0001。

2.2 血清中IL-22、TGF-β的水平

與健康對照組相比，輕、中、重度特應(yīng)性皮炎患者血清中IL-22 細(xì)胞因子的水平均顯著增高(P<0.0001)，中、重度特應(yīng)性皮炎患者TGF-β細(xì)胞因子的水平顯著降低(P<0.0001)，輕度特應(yīng)性皮炎患者TGF-β細(xì)胞因子的水平與健康對照組無顯著差異(P=0.1430)；與輕度、中度特應(yīng)性皮炎患者相比，重度特應(yīng)性皮炎患者血清中IL-22 細(xì)胞因子的水平顯著增高(P<0.0001)，TGF-β細(xì)胞因子的水平顯著降低(P<0.0001)，見表2。

表2 各組受試者血清中IL-22和TGF-β細(xì)胞因子表達(dá)水平

注：與健康對照組相比較，*P<0.0001，△P<0.0001，☆P<0.0001；與輕度、中度AD患者相比較★P<0.0001。

3 討論

特應(yīng)性皮炎通常開始發(fā)生于嬰幼兒時期，其病程漫長呈反復(fù)發(fā)作的過程[4]。在大約三分之一的患者中，AD與過敏表現(xiàn)有關(guān)(如哮喘、食物過敏、季節(jié)性過敏)。最近，協(xié)會也報告了其他的疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、胃腸病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡。還有數(shù)據(jù)顯示這種疾病是增加心血管疾病的危險因素[5]。患者皮膚往往會發(fā)生劇烈瘙癢，嚴(yán)重影響了患者的正常生活。在發(fā)達(dá)國家中兒童的AD患病率可高達(dá)10%-20%[6]。在我國，AD的患病率也是穩(wěn)中有升[7，8]。

AD的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，是免疫、遺傳、環(huán)境、病理、生理等各種各樣的因素相互作用從而產(chǎn)生的結(jié)果。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為免疫畸變是AD起始發(fā)展的一個主要事件(“從內(nèi)到外的假設(shè)”)。而現(xiàn)在有另一種假設(shè)認(rèn)為AD是因?yàn)楸砥て琳洗嬖诠逃腥毕荨Ｓ捎诒砥て琳先毕荩碳の锘蛘呤沁^敏原可以非常輕易地穿透表皮屏障，然后會誘發(fā)免疫反應(yīng)(“由外到內(nèi)假設(shè)”)。近年來，由于在AD患者中發(fā)現(xiàn)絲聚合蛋白突變使得表皮屏障的缺損比免疫畸變得到了更多的支持[9]。皮膚屏障要發(fā)揮正常功能必須依賴絲聚合蛋白，因此絲聚合蛋白基因(FLG基因)的缺陷是導(dǎo)致皮膚屏障缺陷的至關(guān)重要的因素。早在2006年McLean等通過對北歐人群進(jìn)行調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)近20%的AD病例與FLG基因的突變失活有關(guān)[10]。然而FLG基因發(fā)生突變的大多數(shù)患者病情最終也得到緩解，況且還存在著大部分AD患者的FLG基因并沒有發(fā)生突變，因此單純的FLG基因突變并不能解釋所有的AD發(fā)病機(jī)制。與此同時，claudin蛋白與皮膚屏障的缺損也有著非常重要的關(guān)系，它在角質(zhì)層不能發(fā)揮正常功能時，可以起到額外的屏障作用[11]。Kuo等[12]的研究已經(jīng)證實(shí)AD患者存在著表皮claudin蛋白含量下降的臨床表現(xiàn)。不僅Th2細(xì)胞與表皮claudin蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而且皮損區(qū)Th2細(xì)胞因子水平與表皮claudin蛋白的表達(dá)也呈負(fù)相關(guān)，這提示Th2細(xì)胞因子具有使上皮細(xì)胞claudin蛋白下調(diào)的作用。

Th22 是和Th2細(xì)胞、Th1 細(xì)胞等不一樣的新型輔助性T 細(xì)胞亞群，主要通過分泌IL-22等的細(xì)胞因子從而對皮膚屏障功能產(chǎn)生破壞作用[13，14]。Th22細(xì)胞的作用主要與疾病的內(nèi)在機(jī)制有關(guān)，它可誘導(dǎo)表皮增生，也可抑制蛋白參與不真皮分化和皮膚屏障功能，并上調(diào)包括S100A8和S100A9的抗菌肽。本研究發(fā)現(xiàn)，特應(yīng)性皮炎患者的病情嚴(yán)重程度與Th22細(xì)胞及IL-22細(xì)胞因子的表達(dá)成正相關(guān)。是因?yàn)樵诎l(fā)炎的皮膚中，Th22可以通過增強(qiáng)趨化因子和TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞因子來促進(jìn)免疫反應(yīng)[15]，并且在角化細(xì)胞中，IL-22降低了絲聚合蛋白的表達(dá)，加劇了表皮屏障功能障礙[16]。它主要是通過抑制角質(zhì)絲聚合蛋白轉(zhuǎn)錄后加工酶的表達(dá)從而使絲聚合蛋白的表達(dá)降低，進(jìn)而加重皮膚的損傷[17]。任小麗[18]等研究證實(shí)Th22細(xì)胞在特應(yīng)性皮炎患者中分泌的IL-22升高，且與特應(yīng)性皮炎患者的病情嚴(yán)重程度和發(fā)病機(jī)制有著一定的關(guān)系，與本研究結(jié)果相似。Th22在特應(yīng)性皮炎的免疫發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用，但是其具體以什么方式參與的還有待研究，隨著越來越徹底的研究會使針對細(xì)胞因子的靶向治療在特應(yīng)性皮炎的治療中發(fā)揮重要作用。

Tregs通過抑制不同免疫細(xì)胞的分化和增殖，在免疫反應(yīng)中有著很關(guān)鍵的作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞及TGF-β細(xì)胞因子在特應(yīng)性皮炎患者體內(nèi)表達(dá)減少。Treg主要是通過產(chǎn)生TGF-β和IL-10來抑制免疫反應(yīng)的，其機(jī)制是通過表達(dá)CTLA-4，然后CTLA-4通過攜帶酪氨酸抑制基序(ITIM)與B7結(jié)合后從而抑制T細(xì)胞的增殖和分化[20]。Cosmi等[21]發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞具有抑制Th1和Th2的作用，并且對Th1的抑制強(qiáng)于Th2，從而導(dǎo)致Th1/Th2的比例失衡。Ma L[22]等研究發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞及TGF-β與特應(yīng)性皮炎存在著一定的關(guān)系，在特應(yīng)性皮炎中比例降低，與本研究結(jié)果相似。然而Ou LS[23]等研究中指出AD患者外周血中Treg細(xì)胞明顯升高，與本研究結(jié)果截然相反，可能是由于AD的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，其他的免疫因素改變了Treg細(xì)胞的數(shù)量，從而削弱和掩蓋了Treg細(xì)胞及其細(xì)胞因子在AD中的作用。隨著研究的深入，會使通過對TGF-β細(xì)胞因子的靶向治療以及利用抗CTLA-4單抗來阻斷Treg細(xì)胞從而減輕Treg對免疫的抑制作用成為可能。

不同的免疫細(xì)胞通過其分泌的細(xì)胞因子在機(jī)體的微環(huán)境中相互作用，發(fā)揮各自的功能，維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)。Th22和Treg細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-22和TGF-β在特應(yīng)性皮炎發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，可以為特應(yīng)性炎的實(shí)驗(yàn)室診斷提供重要參考，對特應(yīng)性炎的療效評估具有重要意義。