膠原水凝膠在軟骨與骨組織工程中的研究進展

劉永龍 黃江鴻 熊建義 王大平,

膠原水凝膠是一類具有親水基團，不溶解于水卻遇水溶脹并且保持其穩定的三維網格結構的聚合物材料[1]。膠原水凝膠通過共價鍵、范德華力或氫鍵等相互作用而交聯形成三維網狀結構，吸收水后能夠顯著溶脹，保留大量的水分并且能夠保持其原有的三維結構而不被溶解，同時在一定條件下又可以脫水退溶脹。因為其含水量高，溶脹快，結構穩定與組織具有良好的相容性，膠原水凝膠作為仿生支架在軟骨與骨組織工程學方面具有廣闊的研究和發展前景[2]。近幾十年來，隨著國內外科研工作者對膠原水凝膠的結構、性能和應用的研究的逐漸深入，膠原水凝膠在醫學方面的應用前景逐漸引起巨大的關注。

1 膠原水凝膠的性能

膠原作為細胞外基質的主要成分，在維持細胞外基質生物學性能和結構完整性方面起重要的作用。膠原本身具有特殊的四級結構，在特定情況下可以自發聚集形成膠原纖維[3]，并進一步形成水凝膠。膠原的這種自組裝行為不但受到所處環境中的理化因素影響，而且通過引入外源性的添加物，也可以使水凝膠的最終結構、理化性質和生物化性能發生顯著改變。

但是因單純的膠原水凝膠機械強度不足、耐熱性欠佳，有研究表明通過適當降低復合水凝膠中的膠原含量或者對膠原進行改性后制備獲得的復合膠原水凝膠更有利于細胞生長并具備更加良好的生物力學性能。已有進一步的研究發現，將膠原蛋白與其他高分子材料交聯后可以顯著提高水凝膠的拉伸強度及抗降解能力[4]，達到軟骨組織工程應用的要求。隨著研究的深入，外源性引入物的報道層出不窮，除了經典的殼聚糖和聚乙烯醇外，海藻酸鹽、羥基磷灰石、聚乙二醇和透明質酸等材料作為外源性添加物也取得良好的效果。這些外源性添加物雖然不具有膠原的自組裝性能，但是通過與膠原的相互交聯而形成的膠原水凝膠，具備了單純膠原水凝膠所不具備的更加優越的生物力學性能、結構穩定性。

2 復合膠原水凝膠的種類

2.1 膠原-聚乙烯醇復合水凝膠

單純的聚乙烯醇水凝膠因聚乙烯醇本身的親水性和生物惰性，不利于其植入體內的血管的生成。聚乙烯醇進行與膠原等材料交聯制備的復合水凝膠的結構和性能更加接近關節軟骨。有文獻報道[4]將聚乙烯醇與明膠溶液反復冷凍-融化獲得一種大孔徑的不可降解的復合水凝膠生物支架，這種復合水凝膠在兔軟骨缺損模型中保持了良好的固定狀態，并不會引起炎癥反應，也不會對周圍的軟骨產生損害。倪茂君等[5]研究者用輻射交聯與凍融循環相結合的方法，制備出配比最佳的聚乙烯醇/聚乙烯基吡咯烷酮/膠原復合水凝膠，研究發現膠原的含量與復合水凝膠的含水量成正相關，與復合水凝膠的力學強度成負相關。

2.2 殼聚糖膠原復合水凝膠

殼聚糖是多糖中僅有的一種堿性氨基多糖，其來源廣泛，某些理化性質與細胞外基質中的主要成分氨基多糖極其相似，具有良好的天然抗菌性、生物降解性和組織相容性[6]。殼聚糖通過化學修飾改性后可以獲得特殊理化性質，使用改性后的殼聚糖制備的復合水凝膠具有更好的生物相容性和生物力學性能。Liu 等[7]研究者用轉谷氨酰胺酶對殼聚糖進行改性后，改性后的殼聚糖的氨基與被氧化的金剛乙醛的醛基交聯反應。結果表明這種水凝膠具有清晰穩定的三維結構，具有較好的生物相容性和凝血功能。在軟骨組織工程方面，以殼聚糖為組分的復合水凝膠也引起了關注。針對軟組織工程需求的較高機械強度的水凝膠，有文獻報道[8]發現殼聚糖可以有效提高復合水凝膠的生物力學性能，氧化鋯、殼聚糖和明膠交聯而成的高密度復合水凝膠在恒河猴腰椎缺陷模型實驗中表現中較高的抗壓能力，并有類似自體骨的修復效果。Ghorbani 等[9]使用改性后的殼聚糖與明膠、Ⅱ型膠原蛋白和蠶絲蛋白交聯制備的復合水凝膠表現出優良的可注射型，這種復合水凝膠在4℃時表現為透明溶液，在37℃環境下30 min后為凝膠態，并具有良好的組織相容性和細胞吸附性。

2.3 透明質酸膠原復合水凝膠

透明質酸是軟骨細胞外基質的一種成分，在眾多的生物材料中具有優良的生物相容性，更高的結構孔隙率，更大的比表面積，并且具有促進細胞與生物之間結合，調控細胞分化、分裂等生物行為的作用，是一種理想的軟骨組織工程材料。但是單純的透明質酸-膠原復合水凝膠存在生物力學性能較差、機械強度不夠，并且透明質酸作為一種生物多糖容易從支架材料中溶出，使其應用受到限制。Moulisova 等[10]的研究發現，同一種配比制備的透明質酸膠原復合水凝膠，采用化學和光化學交聯方法制備的復合水凝膠與生物酶交聯方法制得的復合水凝膠在生物體內更容易引發炎癥反應。有研究者進一步研究[11]發現，在透明質酸膠原復合水凝膠中適量引入葡萄糖胺可以降低膠原的含量，進而降低復合水凝膠的交聯密度，其生物力學性能更加適用于軟骨組織缺損的修復。值得一提的是，透明質酸作為軟骨細胞基質的一部分，透明質酸細胞外基質復合水凝膠與透明質酸膠原復合水凝膠相比，更能促進人脂肪源干細胞向成纖維細胞的轉化。

2.4 海藻酸鈉膠原復合水凝膠

海藻酸鈉是一種來自褐藻的天然多糖，最早由英國化學家Stanford 首先對其研究，發現它具有濃縮溶液、形成凝膠和成膜的能力，進一步的研究發現其具有優良的生物力學性能、生物相容性和低免疫原性，但是因海藻酸鈉過強的親水性使細胞很難與其產生足夠的黏附性進而影響細胞的生物學行為[12]。膠原對細胞具有良好吸附性而機械性能較差，與海藻酸鈉交聯后可以得到優劣互補的復合膠原水凝膠。有文獻報道對海藻酸鈉用氧化劑進行氧化修飾后得到醛酸鈉，醛酸鈉進一步與甲基丙烯酸甲酯反應后得到的產物與改性后的明膠水溶液混合發生Schiff 反應，然后在365 nm 紫外線照射下交聯形成復合水凝膠。此種復合水凝膠的特點是具有雙交聯二級網絡結構，與單一交聯網絡結構的水凝膠相比，具有更好的力學性能、生物相容性和可控生物降解率。宋益哲等[13]研究者將膠原溶液與海藻酸鈉溶液進行共混處理制備得到膠原-海藻酸鈣互穿網絡水凝膠，該水凝膠孔隙分布均勻，多為貫穿孔，疏水性得到顯著增強使得細胞黏附性增強，更有利于細胞的遷移。

2.5 其他材料與膠原交聯制備的復合水凝膠

除了聚乙烯醇、殼聚糖、透明質酸和海藻酸鈉被廣泛用于膠原復合水凝膠，聚乙二醇[14]、纖維素[15]等與膠原交聯制備的復合水凝膠在創傷血管、神經修復領域均有涉獵。復合膠原水凝膠往往是用于損傷部位，有研究者在復合水凝膠中加入適當的干細胞[16]或者細胞生長因子[17]取得良好的促進組織修復的結果。以Fe3O4為代表的的磁性納米復合水凝膠結合了納米材料更加優良的容水性能和組織相容性與磁性材料的磁場響應性[18]，磁性納米顆粒在一定時間里可被骨髓間充質干細胞吞噬，從而避免了在體內組織殘留的問題，這種水凝膠可應用于藥物的運輸、釋放[19]，骨與軟骨組織工程填充材料[20]等醫學領域。

3 膠原水凝膠的制備及其應用

3.1 膠原水凝膠的交聯方法

膠原水凝膠本質是一種高分子聚合物，根據其鍵合方式的不同，交聯方法可分為物理交聯和化學交聯兩種方法。

3.1.1 物理交聯

物理交聯是在紫外光照射[21]、射線輻照[22]、加熱、冷凍干燥[5,8]等物理處理條件下，氫鍵、離子鍵、結晶區域或疏水作用等非共價鍵作用使高分子產生相互交聯的一種方式。通過物理交聯制備的膠原水凝膠形態不具備永久性，常溫下為凝膠態，通過加熱可以轉化為溶液，故又稱之為“假凝膠”。物理交聯方法的優點是交聯過程中凝膠的各組分不產生化學反應，避免了可能有毒性作用的新物質產生，但是其不足也很明顯，生物力學強度和熱穩定性不足，制備出的膠原水凝膠的結構均勻程度也有欠缺[6]。目前報道的適用物理交聯方法的主要有殼聚糖、葡萄糖、聚乙烯醇、海藻酸等。

3.1.2 化學交聯

化學交聯是通過選用合適的交聯試劑對膠原中的羧基、氨基等官能團進行修飾與反應，高分子鏈相互交聯后形成需要的膠原水凝膠。在化學交聯中交聯劑的選擇起到關鍵性的作用，交聯劑多為帶醛基的化學試劑，如：戊二醛、聚乙烯醇等。化學交聯方法的優點是制備出的膠原水凝膠的生物力學性能和熱穩定性較好，缺點是生物降解性和生物相容性較差[19]，尤其是小分子的二醛可能具有細胞毒性。目前報道的化學交聯方法使用的交聯劑包括：乙二醛、聚丙烯酸、聚乙二醇等。

3.2 膠原水凝膠在軟骨與骨組織工程中的應用

3.2.1 膠原水凝膠在軟骨組織工程中的應用

軟骨組織缺損一直是骨科基礎與臨床研究領域面臨的一大難題。在軟骨組織工程的研究中，關于各類型的膠原基復合水凝膠的報道層出不窮。隨著研究的深入，膠原水凝膠在軟骨組織工程方面的應用不再只滿足于單純的填充修復，科研人員發現可以將軟骨組織工程三要素：種子細胞、支架材料及細胞因子[23]中的種子細胞和細胞因子加入到復合膠原水凝膠這種仿生材料中，使這種仿生材料在填充軟骨缺損的同時具有誘導軟骨生成的作用[1,15]，從而得到一個三位一體的解決方案。Fensky 等[24]將人間充質干細胞加入到復合膠原水凝膠中，體外實驗表明10 d 后復合膠原水凝膠中的人間充質干細胞表現出向軟骨分化的傾向。可注射型膠原水凝膠有廣泛的應用前景，受到生物材料學家的特別關注，因為它們可以以最小代價完成微創手術進行注射，如圖1 所示膠原水凝膠在軟骨組織工程應用過程，可注射性膠原水凝膠可以任意形成以匹配不規則的缺陷形狀達到修復軟骨組織損傷的目標[25]。

3.2.2 膠原水凝膠在骨組織工程中的應用

臨床中骨缺損發生的病理機制具有高度復雜性，尤其是大面積的骨組織缺損，骨組織填充材料的研究對骨組織工程的發展起著非常重要的作用[26]。有學者[27]認為骨缺損填充材料本身的力學結構性能和其與骨組織的連接緊密程度是骨缺損修復成功與否的關鍵。種類眾多的骨缺損填充材料中骨水泥、鈦合金、鉭合金、磷酸三鈣[28]等填充材料的研究較為廣泛。有研究[29]發現高強度的膠原水凝膠因為更好的組織相容性和多孔隙結構是一種良好的骨缺損填充材料。Xavier 等[30]制備的納米復合膠原水凝膠中含有納米級別的硅酸鹽顆粒，強度顯著提升并且與周圍骨組織的緊密程度增加，在沒有加入任何誘導因子的情況下仍然能夠促進骨組織的生成。Yuan 等[31]研究者使用納米殼聚糖制備的復合膠原水凝膠也取得類似的結果。

圖1 可注射型膠原水凝膠修復軟骨組織損傷

4 討論

經過科研人員的不斷探索，膠原水凝膠應用于軟骨與骨組織工程的研究不斷深入，然而軟骨與骨組織工程對生物材料在生物學力學性能、組織相容性和降解性等有很高要求，膠原水凝膠在軟骨與骨組織工程領域的研究仍有進一步探索的空間。

以具有優良組織相容性的膠原為基礎，進而探尋其他合適的一種或者多種與膠原形成優勢互補的生物材料按照一定工藝流程與膠原共同制備出適用于軟骨與骨組織工程的生物支架材料，這既是膠原水凝膠設計的核心思路，也是設計的難點[32]。軟骨與骨組織工程對生物支架材料的生物力學性能有很高的要求，在設計膠原水凝膠時必須保證其具有一定的生物力學性能。提高膠原水凝膠的生物力學性能有兩種途徑：原材料的篩選和制備工藝的優化。膠原本身的機械強度不足，但是可以引入具有優良生物力學的生物材料組分。不論是傳統的生物材料如殼聚糖、聚乙烯醇等，還是近期蓬勃發展的新型生物材料如納米材料、磁性材料等，通過調節組分原材料的比例以獲得滿意的生物力學性能是一種較有效的解決思路。另一方面，制備的工藝也對膠原水凝膠內部微觀結構的穩定性起到決定性的作用。與物理交聯相比，化學交聯制備出的膠原水凝膠的生物力學穩定性一般更優[19]，但是制備工藝中影響膠原水凝膠生物力學性能的因素很多，作者在研究中發現即使是相同的組分、同一種交聯方法，制備過程中的處理溫度、時長等因素都會影響到膠原水凝膠最終的生物力學性能。膠原水凝膠的制備流程還需考慮原材料的特性，適當情況下，多種交聯方式結合也是一種很好的選擇。

膠原水凝膠做為一種植入性生物材料，應具有優良的組織相容性，同時具有可控的降解性。設計膠原水凝膠時選取的組分原材料本身應具有一定組織相容性，對于組織相容性較差的組分，可以適當降低其比例以達到預期的組織相容性。應特別注意制備過程中其他引入物對膠原水凝膠的組織相容性的影響，有影響的引入物包括交聯劑、發泡劑和采用化學交聯制備過程中生成的其他產物[4]。應用于軟骨與骨組織工程的膠原水凝膠在體內的降解應與軟骨與骨組織的再生修復同步銜接進行。膠原水凝膠的生物力學穩定性與可降解性有一定的沖突關系，而在降解過程中維持一定的生物力學穩定性也是一個研究的難點，調節二者之間的關系需要大量的重復實驗進行探索。膠原水凝膠體外的降解實驗具有簡單易行、低成本的優點，可以初步評估膠原水凝膠的降解性能，準確的降解性能數據則需要進行動物實驗進行采集，在時間、精力和經濟方面的成本較高。

目前國內外尚無商品化的膠原水凝膠產品應用于軟骨與骨組織工程，相關的研究大多停留在制備工藝和動物實驗的探索階段。對于膠原水凝膠的性能評估與測定，主要包括微觀表征、含水率、溶脹性、拉伸與壓縮性能、組織相容性、降解性和細胞增殖、分化的指標測定[33]，雖然最重要的指標還是其在軟骨與骨損傷表面的修復效果[11]，但是某一項指標的短板出現都可能導致所制備的膠原水凝膠不能達到軟骨與骨組織工程的要求。目前國內外學者的研究熱點是將膠原水凝膠與相關干細胞結合，期望制備出能夠誘導軟骨與骨細胞分化，具有更加優良修復效果的膠原水凝膠；同時研究人員也正致力于將交叉學科和新型材料與膠原水凝膠聯合，諸如3D 打印技術[34]、合金材料、陶瓷材料和磁性材料有望與膠原水凝膠結合，為膠原水凝膠在軟骨與骨組織工程領域的研究注入新的探索方向。

5 總結與展望

膠原水凝膠因其具有良好的組織相容性和低免疫原性，具備作為軟骨組織工程仿生支架的先天優勢，雖然其本身具有機械強度不夠、熱穩定性較差的缺點，但是通過眾多研究者的努力，多種其他生物材料與膠原形交聯形成的復合水凝膠具備了不同生物材料間優勢并且互補了材料間的短板。膠原與其他生物材料交聯成的復合水凝膠，因其良好的生物相容性、低免疫原性，優良的生物理化性質，作為軟骨組織工程三要素：種子細胞、支架材料及細胞因子[32]。并且隨著相關交叉學科的發展，3D 打印技術、陶瓷材料與復合水凝膠的結合的優勢也逐漸體現出來，比如通過3D 打印技術制備的聚乙二醇膠原復合水凝膠在血管移植方面的探索；納米材料、磁性材料與膠原水凝膠交聯制備的新型復合膠原水凝膠在藥物運輸[26-27]和軟骨組織修復方面[28]的研究也在逐漸深入。