新西蘭大白兔佐劑性關節炎模型的評價

陳芳 劉琴 王麗平 陳利鋒 張宜 楊鴻*

類風濕性關節炎（RA）是一種慢性自身性免疫性疾病，其病因和發病機制尚未完全明確，在治療方面亦無特效治療措施[1]。全球有0.5%～1%的人群受到此疾病的影響，該病不僅致殘率高，還可引起血管炎、心包炎等并發癥，嚴重影響患者的生活質量，造成巨大的家庭和社會負擔[2]。尋找安全、有效緩解RA 病情的藥物是目前治療RA 的重點[3]。佐劑性關節炎（adjuvant arthritis，AA）動物模型已經廣泛用于類風濕性關節炎發病機制的研究和評估潛在的抗類風濕性關節炎藥物的臨床應用[4]。而從報道文獻來看，兔RA 動物模型普遍存在標準不一、流程各異和細節不清的問題，特別是檢測指標不統一等，甚至只是從肉眼來判斷，諸多設計思路也值得商榷。如何復制出更接近RA 的動物病理模型一直成為困擾風濕免疫科研工作者的難題，因此尋找發病機制更接近RA 的動物模型具有重要的臨床意義[5]。本研究旨在建立一個較完整的兔佐劑性關節炎動物模型，為研究關節疾病的發病機制、病理變化以及藥物療效、作用機制提供一個實驗平臺。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康新西蘭大白兔16 只，雌雄不限，體質量2.5 ～3.0 kg，清潔級，由武漢市新洲區萬千佳禾實驗動物養殖場提供[SCXK(鄂)2017-0045]，本實驗在廣州軍區武漢總醫院醫學實驗科動物實驗設施內進行[SYXK(鄂)2014-0082]。本實驗經中國人民解放軍中部戰區總醫院（中國人民解放軍武漢總醫院）倫理委員會批準進行[武總動(福)第2018038 號]。

1.2 實驗試劑及儀器

弗式完全佐劑（Sigma 公司，美國）；蘇木素、伊紅Y（水溶性）、無水乙醇、二甲苯、鹽酸、包埋石蠟、中性樹脂等由國藥集團提供；脫鈣液（硝酸-甲醛液，按甲醛15 mL，蒸餾水90 mL，純硝酸20 mL 比例來配制），硝酸和甲醛由武漢市潔洋盛科技公司提供；病理切片機（Leica RM2016輪轉式切片機，德國），組織攤烤片機（武漢俊杰JK-6 生物組織攤烤片機），顯微鏡（尼康E100 型生物顯微鏡），倒置熒光顯微鏡（奧林巴斯，日本），軟皮尺等。

1.3 實驗方法

1.3.1 AA 兔模型的建立[6]

新西蘭兔16 只，1 只/籠進行分籠喂養，隨機分組為正常組（8 只）和模型組（8 只），飼養間溫度18 ～24℃，相對濕度40%～60%。新西蘭兔適應性喂養1 周后，足爪剃毛稱體重，測足趾部的周徑。模型組初次誘導：將家兔背部肩胛骨間及雙膝關節以下的毛用脫毛劑脫去，每只新西蘭兔右跖部皮下注射弗氏完全佐劑0.4 mL，同時注射背部4 點，每點0.2 mL。加強誘導：注射后7 d 加強注射弗式完全佐劑1 次，每只新西蘭兔右跖部皮下注射弗氏完全佐劑0.4 mL；背部任意2 點，每點注射0.2 mL。

1.3.2 AA 兔模型的鑒定

1.3.2.1 雙側足趾周徑測定

采用軟皮尺于造模前、造模后24 d 分別測定各組家兔雙足跖周徑變化。測量時注意取相同松緊度，于足趾腫脹最高點進行測量。

1.3.2.2 兔雙足X 線片變化

隨機抽取正常組和模型組兔各3 只，于我院放射科行雙足斜位X 線片。并對其足趾軟組織腫脹度、關節變化情況進行評價。

1.3.2.3 滑膜組織HE 染色

在取材之前對兔肉眼所見拍照，并在取材過程中拍下一些典型的病變特征。實驗動物脫臼處死，取踝關節，修剪整齊后，放入10%的甲醛固定液中，固定1 周后，轉入甲酸脫鈣液中，脫鈣至骨質變軟，用小刀切取軟骨，修剪成0.5 cm×0.4 cm×0.3 cm，并包埋（梯度乙醇脫水、二甲苯脫水、透明，石蠟包埋切片，分別用蘇木精-伊紅染色）。

1.4 統計學方法

用SPSS 19.0 統計軟件進行統計學處理，數據以均數±標準差表示，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AA 兔足趾周長的影響

表1 結果顯示，造模前，各組間右足趾周長差異無統計學意義（P＞0.05），造模各組右足趾周長差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性；造模組足趾周長均較正常組明顯升高（P＜0.05）。

表1 各組實驗兔致炎側足趾周長比較

表1 各組實驗兔致炎側足趾周長比較

注：*與正常組比較＜0.05。

組別 n(只） 致炎側足趾周長（cm）造模前 造模后正常組 8 5.98±0.14 6.08±0.08模型組 8 5.92±0.12 7.96±0.45*

2.2 AA 兔X 線片表現的影響

X 線片結果顯示，與正常組比較，模型組AA 兔軟組織腫脹明顯，關節間隙變窄甚則模糊，骨皮質變薄（見圖1）。

圖1 各組實驗兔雙足X 線片：A.正常組；B.模型組

2.3 AA 兔足關節外部觀察及HE 染色結果

新西蘭兔造模24 d 后，外部觀察足關節及足趾部明顯腫脹變形（見圖2A、圖2B），解剖可見踝關節腔有明顯的積液（見圖2C、圖2D）,解剖可見模型兔足趾部有明顯微血管增生和炎癥（見圖2E、圖2F）；滑膜組織切片HE 染色顯示，正常組的滑膜細胞呈現“串珠樣”規則排列（見圖3A），而模型組的滑膜細胞排列紊亂，而且還出現細胞水腫現象（見圖3B），模型組的滑膜層出現大量的炎性細胞和多核巨噬細胞（見圖3D）而正常組無炎性細胞（見圖3C），提示AA 兔模型制備成功。

圖2 新西蘭兔的足爪、關節腔及足關節的病變特征：A.正常組足；B.模型組足；C.正常組足關節；D.模型組足關節；E.正常組爪解剖面；F.模型組爪解剖面

圖3 新西蘭兔足關節滑膜組織HE 染色：A.正常組滑膜組織HE 染色呈現“串珠樣”規則排列（×200）；B.模型組滑膜組織HE染色出現細胞水腫現象（×200）；C.正常組滑膜組織HE 染色無炎性細胞（×200）；D.模型組滑膜組織HE 染色，滑膜層出現大量的炎性細胞和多核巨噬細胞（×200）

3 討論

雖然目前對RA 的研究已經深入到細胞水平、分子水平以及基因水平，但RA 的病因和發病機制極其復雜，為醫學上仍未解決的難題[7]。其臨床表現為對稱性的多關節腫脹、疼痛，最終可造成關節結構破壞、功能障礙，甚至致殘[8]。據臨床觀察，RA 的主要病理特征為：關節滑膜炎，滑膜組織增生以及對骨和軟骨的結構性損傷。RA 的病理過程主要是關節炎癥細胞及浸潤和滑膜細胞增殖和侵襲，形成侵襲性血管翳，導致骨和軟骨破壞[9]。動物模型是研究RA 的發病機制和藥效學的重要手段之一。常用于制備模型的動物主要是大鼠，其次是兔，但是由于小動物在生理學和免疫學方面與人類有很大的不同，相比大鼠關節炎模型，弗氏完全佐劑（complete Freund's adjuvan，CFA）誘導的兔關節炎模型在病理變化方面更接近人[10-11]，這就使得探索建立大動物模型變得尤為必要。AA 兔模型又稱弗氏佐劑關節炎兔模型，是一種使用廣泛的風濕性關節炎動物模型，可用于預測多種藥物對RA 的臨床療效。早期動物的炎癥反應的部位常出現在四肢并不斷加重，活動不便，尾部潰爛，出現類風濕結節，體重下降，特別是繼發性自身免疫性腫脹，這些表現與人的RA 表現相似。AA 兔模型是RA 的經典模型，已較為成熟，與人的病理過程十分的相似。本研究中將兔作為研究對象，采用多次多點于新西蘭兔右跖部皮下注射CFA 誘導AA 兔模型，造模3 周后，外部觀察足關節及足趾部明顯腫脹，嚴重致跛行，解剖可見模型兔足趾部有明顯微血管增生和炎癥，滑膜組織切片HE 染色顯示，正常組的滑膜細胞呈現“串珠樣”規則排列，而模型組的滑膜細胞排列紊亂并出現水腫，這些表現與類風濕性關節炎相符。

成功的AA 動物模型除了在病理學上與臨床一致，同時需要具備操作簡單、可重復性等特點，并且用于造模的實驗動物、試劑易購買等[12]。本研究旨在尋求一種較為穩定的AA 兔模型制作體系，只有規范了動物模型，后續的實驗研究才具有科學性。因此筆者在實驗過程中體會到AA 兔模型的規范化需要做大量工作。一是實驗動物質量和倫理的程序化要求。應重視實驗動物質量合格證號及單位倫理審核號。二是實驗設計的科學性要求。皮下注射CFA 的量及時間都應慎重，在前期的預實驗過程中發現CFA 的量少，造模不成功，量多導致兔狀態極差，影響后續實驗的開展，發現皮下注射CFA 后，前1 周有一個急性期，而加強1 周后趨于穩定。脫鈣是骨組織制片中的重要步驟，也是病理技術難點，而脫鈣劑的選擇十分重要。關節結構既包含致密的骨組織，又包含周圍的肌肉、韌帶等軟組織，因此對其病理制片前期處理的要求更高，即要充分脫鈣又不能損傷軟組織形態結構[13-14]。在取材脫鈣的過程中，脫鈣液的配制以及脫鈣時間也需要去探索，室溫越高作用效果越明顯，也就是夏天的脫鈣效果比冬天脫鈣效果好，否則脫鈣不完全或脫鈣太過，會對切片造成影響。三是有效性指標的要求。在實驗中評價一個模型的建立是否成功，應該由病理特征為依據，而不是通過肉眼觀察，前期實驗過程中，很容易被急性期迷惑。病理特征為依據應當與臨床類風濕性關節炎的病變特征相結合來考慮，這樣建立的模型才能更好地為臨床中西藥研究服務。