模擬酸雨對(duì)華重樓生理生化特性的影響①

王春燕

（四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 四川成都610066）

環(huán)境問(wèn)題是當(dāng)今國(guó)際社會(huì)的普遍問(wèn)題，我國(guó)的環(huán)境問(wèn)題也比較嚴(yán)重，其中，酸雨已成為生態(tài)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，因其對(duì)植物可能造成不可估量的損失，引起研究者們的廣泛關(guān)注［1]。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，化石燃料使用量的日益劇增，大氣質(zhì)量的日益下降，我國(guó)的酸雨問(wèn)題日益嚴(yán)峻，已成為全球第三大酸雨區(qū)［2-4]。我國(guó)酸雨區(qū)主要分布在長(zhǎng)江以南，其中西南、華南地區(qū)尤為嚴(yán)重，大部分降水的pH 值低于4.5［5]。有關(guān)酸雨對(duì)陸生植物生長(zhǎng)發(fā)育及生理特性的影響國(guó)內(nèi)外已有較多報(bào)道，其中酸雨對(duì)黃瓜葉片、甜菜葉片、樺樹(shù)根系等抗氧化系統(tǒng)的研究表明，酸雨對(duì)SOD、POD、CAT 活性的影響隨著酸雨脅迫時(shí)間、脅迫強(qiáng)度及植物種類的不同而出現(xiàn)不同的規(guī)律［6]。酸雨會(huì)使植物葉片變黃脫落，破壞植物葉片結(jié)構(gòu)，降低葉綠素含量，影響植物酶活性［7]。

華重樓（Paris polypHyllavar. chinensis），又稱七葉一枝花，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，主要分布于我國(guó)西南部的云南、四川和貴州一帶，具有清熱解毒，消腫止痛、止血、治療跌打損傷、祛痰、抑菌、抗早孕等功效，是云南白藥、熱毒清、季德勝蛇藥片和宮血寧等中成藥的主要原材料［8]。華重樓為多年生草本植物，繁殖率較低，地下根狀莖生長(zhǎng)十分緩慢，從種子發(fā)芽到入藥一般需10～15年。近年來(lái)，由于大量采挖，野生華重樓資源日益減少，嚴(yán)重威脅以其為原料的醫(yī)藥工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，因此，人工栽培成為必然趨勢(shì)，而酸雨對(duì)華重樓栽培的影響不可忽視。本文主要以四川大渡河的華重樓為研究對(duì)象，通過(guò)不同pH 模擬酸雨溶液處理，研究酸雨脅迫對(duì)植物各項(xiàng)生理指標(biāo)的影響及變化規(guī)律，為華重樓人工栽培管理提供科學(xué)依據(jù)［9-10]，為進(jìn)一步開(kāi)展酸雨環(huán)境對(duì)華重樓生長(zhǎng)的脅迫機(jī)理和華重樓的逆境生理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地與材料

試驗(yàn)地點(diǎn)為四川師范大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)園。該實(shí)驗(yàn)園位于成都郊區(qū)，屬亞熱帶溫濕季風(fēng)氣候，年平均降雨量為881.9mm，其中酸雨率為30%左右。每年7～9月為酸雨高發(fā)期，其中8月酸雨率最高，達(dá)到36.7%。

選擇長(zhǎng)勢(shì)、形態(tài)基本一致的野生華重樓75株，2015年5月移栽入上、下口直徑分別為35、25cm，高30cm 的塑料花盆中，每盆1 株，對(duì)所有苗盆進(jìn)行編號(hào)、掛牌，用壤土精細(xì)栽培，緩苗期間用自來(lái)水澆灌，6月開(kāi)始噴灑酸雨。

1.2 方法

1.2.1 模擬酸雨溶液配制

用98%的濃硫酸和68%的濃硝酸配置3 種不同比例的母液：H2SO4∶HNO3（V/V）＝8∶1；H2SO4∶HNO3（V/V）＝1∶1 和H2SO4∶HNO3（V/V）＝1∶8，用蒸餾水將各母液稀釋成pH5.5、4.5、3.5、2.5 的酸雨噴灑液［11]。每次酸雨噴淋量根據(jù)當(dāng)?shù)卦戮涤炅看_定。注意整個(gè)酸雨噴施試驗(yàn)需在透光的塑料大棚中進(jìn)行，以減少自然降雨的影響，同時(shí)用pH6.8的蒸餾水噴施作為對(duì)照。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，將華重樓隨機(jī)分成5 組，每組15 株。根據(jù)成都地區(qū)多年月均降雨量計(jì)算每次模擬酸雨噴淋量，對(duì)各組華重樓植株分別噴淋已配制好的pH 值為2.5、3.5、4.5、5.5 的模擬酸雨溶液，每組噴淋相同pH 值溶液，不同組噴淋不同pH 值溶液，每次每盆植株的噴淋量約100mL，同時(shí)做對(duì)照試驗(yàn)［12]。所有盆栽植株每隔7 d 噴淋一次。整個(gè)試驗(yàn)期間除噴施酸雨的濃度不同外，其余環(huán)境條件保持一致。

1.2.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

酸雨脅迫處理7 d 后，隨機(jī)選擇不同組植株各3 株，選取長(zhǎng)勢(shì)良好的葉片測(cè)定光合色素含量、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA），每個(gè)生理指標(biāo)測(cè)定3 次［13]，取平均值。葉面積測(cè)定采用SHY-150型活體掃描式葉面積儀。

鮮葉中葉綠素含量的測(cè)定：采用乙醇提取法分別測(cè)定665、649 和470 nm 的OD值，按公式計(jì)算組織中各色素的含量。

丙二醛（MDA）的含量測(cè)定：采用硫代巴比妥酸（TBA）法測(cè)定其含量［14]。

酶活性測(cè)定：采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶（POD）活性［15]；氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Excel 2010 和SPSS 19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和單因素方差分析（One-way ANOVA），采用LSD 多重比較法檢驗(yàn)各處理間差異顯著性（p＜0.05），并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸雨脅迫對(duì)華重樓葉片的傷害

由表1可知，CK處理后，華重樓的葉片未出現(xiàn)可見(jiàn)傷害；pH5.5 酸雨處理后，華重樓葉片出現(xiàn)輕微傷害；隨著酸雨酸度的增加，華重樓葉片的傷斑面積隨之?dāng)U大。pH4.5 酸雨處理后，華重樓葉片出現(xiàn)較明顯的傷害；pH3.5 酸雨處理后，華重樓葉片出現(xiàn)明顯傷害；pH2.5 酸雨處理后，華重樓葉片出現(xiàn)傷斑。

表1 在不同酸度的模擬酸雨處理下華重樓葉片的傷害程度

2.2 酸雨脅迫對(duì)華重樓葉綠素含量的影響

由表2～3 可知，CK 處理后，華重樓葉片葉綠素含量最高；當(dāng)pH5.5～6.8 時(shí)，華重樓葉片葉綠素含量與對(duì)照相差不大；pH低于4.5時(shí)，葉綠素含量急劇降低；與對(duì)照相比，pH 值為2.5 時(shí)，華重樓葉片葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a + b 和葉綠素a/b分別降低了73.21﹪、67.21﹪、70.71﹪、17.98﹪。不同pH 模擬酸雨溶液處理下華重樓葉片的葉綠素總量和葉綠素a/b 含量均有一定程度的降低。pH3.5 模擬酸雨溶液處理的華重樓葉片內(nèi)葉綠素a和葉綠素總量達(dá)與對(duì)照差異顯著。

表2 模擬酸雨處理下華重樓葉片中葉綠素a和葉綠素b的含量

表3 模擬酸雨處理下華重樓葉片中葉綠素a+b的含量和葉綠素a/b比值

2.3 酸雨脅迫對(duì)華重樓葉片丙二醛含量的影響

由表4 可知，CK 處理華重樓葉片丙二醛（MDA）含量最低；pH5.5～6.8 時(shí)，隨著pH 的降低華重樓葉片MDA 含量迅速增加；pH3.5～5.5時(shí)，隨著pH 值的降低，華重樓葉片MDA 含量緩慢增加；當(dāng)pH 值在2.5～3.5 之間時(shí)，隨著pH 值的降低，華重樓葉片MDA 含量迅速升高。與對(duì)照相比，pH2.5 時(shí)，模擬酸雨處理15、30、45 d 后華重樓葉片MDA 含量分別增加了52.43%、56.04%、29.16%，此時(shí)華重樓葉片受到嚴(yán)重傷害，膜脂過(guò)氧化作用增加，膜受到一定傷害，使丙二醛的含量急劇增加。

2.4 酸雨脅迫對(duì)華重樓葉片抗氧化酶活性的影響

在逆境脅迫下，植物體內(nèi)的活性氧數(shù)量劇增，植物的抗氧化酶活性迅速升高，對(duì)清除活性氧起到重要應(yīng)激反應(yīng)，成為環(huán)境脅迫下植物應(yīng)激反應(yīng)的重要檢測(cè)指標(biāo)［16]。超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）是抗氧化酶系統(tǒng)中控制植物體內(nèi)活性氧積累的最主要的酶，SOD 是植物抗氧化的第一道防線，能清除細(xì)胞中多余的超氧陰離子；POD 可以使H2O2歧化成無(wú)毒害的水和氧分子。

表4 在不同酸度的模擬酸雨處理下華重樓葉片丙二醛的含量

2.4.1 酸雨脅迫對(duì)華重樓葉片過(guò)氧化物酶（POD）活性的影響

由圖1可知，pH5.5～6.8時(shí)，華重樓葉片過(guò)氧化物酶POD活性趨于穩(wěn)定；pH2.5～5.5時(shí)，華重樓葉片過(guò)氧化物酶POD 活性隨pH 值得的降低呈迅速上升的趨勢(shì)，其中pH2.5～3.5時(shí)，POD活性變化最為明顯。

圖1 模擬酸雨對(duì)華重樓葉片過(guò)氧化物酶POD活性的影響

2.4.2 酸雨脅迫對(duì)華重樓葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

由圖2可知，用不同酸度的模擬酸雨處理華重樓15、30、45 d 后，華重樓葉片中超氧化物歧化酶（SOD）活性變化趨勢(shì)是一致的，都是隨著pH的降低，SOD活性呈迅速上升的趨勢(shì)。

3 討論

酸雨與植物互作是個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，一方面酸雨破壞植物葉片表皮和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，另一方面植物受到酸雨脅迫時(shí)，體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)激活，進(jìn)而清除體內(nèi)由于酸雨脅迫引起過(guò)量的活性氧（ROS）［17]。有研究表明，施與植物適當(dāng)強(qiáng)度的鍛煉或預(yù)脅迫，可以增強(qiáng)植物在逆境中的生存能力和抵抗力。本試驗(yàn)通過(guò)模擬酸雨處理，華重樓葉片出現(xiàn)不同程度的可見(jiàn)傷害，同時(shí)葉片內(nèi)的SOD活性和POD活性均有不同程度的上升，這可能是由于酸雨脅迫過(guò)程調(diào)節(jié)的結(jié)果，在逆境中華重樓的抗氧化酶活性等生理指標(biāo)也發(fā)生了明顯變化［18-19]。

圖2 模擬酸雨對(duì)華重樓葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

酸性環(huán)境脅迫下，MDA 是反映膜脂過(guò)氧化程度以及膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性最直接的指標(biāo)，可用于衡量細(xì)胞膜受傷害的程度［20]。酸雨可影響細(xì)胞活性氧代謝系統(tǒng)的平衡，破壞活性氧清除酶系［21]，有研究報(bào)道表明，酸雨使植物的丙二醛（MDA）含量增加，膜保護(hù)酶超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD），脂質(zhì)過(guò)氧化作用增強(qiáng)。SOD 活性增加，可抵抗由于酸雨造成體內(nèi)活性氧的增加，從而抑制膜脂的過(guò)氧化作用，但是倘若酸雨脅迫強(qiáng)度超過(guò)植物體SOD的耐受限度，則SOD活性會(huì)隨著pH值下降而逐漸喪失，甚至失去清除活性氧的能力［22]。

4 結(jié)論

酸雨對(duì)華重樓葉片可見(jiàn)傷害的典型癥狀是葉片退綠變淡，葉面有黃褐色傷斑；嚴(yán)重的會(huì)造成葉片枯萎，提前脫落。葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要色素，在光合作用的光吸收中起著核心的作用。酸雨脅迫下，植物的光合作用在可見(jiàn)傷害發(fā)生前已經(jīng)明顯受到抑制。本試驗(yàn)中不同pH 值模擬酸雨處理?xiàng)l件下，華重樓葉片葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a +b 和葉綠素a/b 的變化趨勢(shì)一致，都是隨著pH的增加而增加。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，華重樓葉片生長(zhǎng)的各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)酸脅迫的敏感度不一樣。弱酸處理對(duì)華重樓葉片保護(hù)酶活性無(wú)顯著影響，但局部會(huì)有波動(dòng)，這是受酸性條件脅迫后，華重樓葉片內(nèi)過(guò)氧化產(chǎn)物增多而啟動(dòng)的一種應(yīng)激機(jī)制。當(dāng)葉片內(nèi)氧化產(chǎn)物積累到一定水平后，華重樓葉片內(nèi)保護(hù)酶（SOD，POD）活性隨酸性的增強(qiáng)而急劇降低。

目前，有關(guān)酸雨對(duì)藥用植物華重樓生長(zhǎng)的影響研究不多，尤其是對(duì)華重樓抗氧化酶系統(tǒng)的研究較少。因此，有必要在研究華重樓抗氧化系統(tǒng)的同時(shí)考察植物次生代謝產(chǎn)物含量的變化，將華重樓的生理變化和有效成分研究相結(jié)合，將華重樓在逆境下各項(xiàng)變化與該藥材的形成與發(fā)展相結(jié)合。