體素內不相干運動成像在體檢測人類結腸癌SW480裸鼠耐藥性

謝 琦，陳惠嫻，杜 磊，廖炎輝，譚智霖，楊逸銘，吳敏儀，黃偉玲，，張鼎旋，

(1.廣州醫科大學附屬廣州市第一人民醫院南沙醫院醫學影像科，廣東 廣州 511457；2.華南理工大學附屬第二醫院南沙醫院醫學影像科，廣東 廣州 511457；3.廣東省中醫院醫學影像科，廣東 廣州 510030；4.番禺中心醫院醫學影像科，廣東 廣州 511400)

多數結腸癌患者診斷時已是中晚期，一般以5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)化療為主，化療過程中腫瘤細胞易出現對化療藥物的耐受[1]，患者無進展生存期僅8.7～12.3個月。目前主要通過體外檢測腫瘤標記物監測腫瘤細胞耐藥性，亟待尋找影像學方法活體監測腫瘤細胞耐藥性。體素內不相干運動(intravoxel incoherent motion，IVIM)成像可提供與組織生理特性、細胞和細胞膜結構的相關信息，如細胞組織結構、微結構和微循環[2]。本研究探討IVIM活體檢測結腸癌小鼠對5-FU耐藥性的可能。

1 材料與方法

1.1 人類結腸癌耐藥細胞株的建立 將人類結腸癌SW480親代細胞株(購自中山大學動物中心細胞庫)培養于37℃完全新鮮培養液、5% CO2孵箱中，細胞處于對數生長期時，換為含6 μg/ml 5-FU的培養液培養24 h，再換為無5-FU的完全培養液培養，1～2天換液1次，待細胞重新恢復正常增殖、生長至對數生長期時傳代，再以含此濃度5-FU的培養液沖擊培養誘導耐藥細胞株，交替培養6個月，獲得可在6 μg/ml 5-FU濃度中穩定生長的人類結腸癌SW480耐藥細胞株，即SW480/5-FU。

MTT比色法檢測人類結腸癌親本SW480、耐藥SW480/5-FU細胞半抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)，計算耐藥指數 (resistance index,RI)：RI=SW480/5-FU IC50/SW480 IC50。

1.2 荷瘤鼠模型制備 選取10只健康BALB/c裸小鼠(購自中山大學實驗動物中心)，雌性，5～6周齡，體質量約16～18 g。將其分為耐藥組(n=5)和不耐藥組(n=5)，分別于其雙側大腿根部皮下注入SW480/5-FU和SW480細胞懸液(0.2 ml/側，細胞濃度4×107/ml)，定期觀察腫瘤生長情況，待腫瘤生長至最長徑1.50 cm以上行MR檢查。

1.3 MR檢查 采用Siemens Magnetom Skyra 3.0T MR系統，上海辰光8通道相控陣鼠標式鼠線圈。腹腔麻醉荷瘤鼠后以俯臥位保定進行MR掃描：T2W快速自旋回波(turbo spin echo,TSE)序列，TR 4 500 ms，TE 110 ms，層厚2 mm，層間隔0，FOV 128 mm×128 mm，NAS 4，采集矩陣128×128，重建矩陣512×512，行軸位(圖1A)、冠狀位(圖1B)、矢狀位成像，掃描時間2 min 2 s；T1W TSE序列，TR 2 780 ms，TE 15 ms，層厚2 mm，間隔0，FOV 200 mm×200 mm，NAS 2，采集矩陣200×200，重建矩陣768×768，行冠狀位成像(圖1C)，掃描時間1 min 46 s；DWI采用EPI序列，軸位，TR 3 400 ms，TE 60 ms，按各向同性施加擴散敏感梯度場，取8個b值(0、50、100、150、200、400、800、1 200 s/mm2)。FOV 220 mm×220 mm，NAS 3，層厚2 mm，采集矩陣220×220，重建矩陣308×308，掃描時間13 min 39 s。

圖1 荷瘤鼠MR成像 A.軸位T2WI;B.冠狀位T2WI;C.冠狀位T1WI

由2名放射科醫師以盲法對多b值DWI圖像進行分析，意見不同則經協商達成一致。將多b值DWI數據導入MITK Diffusion Version 2013.03.00軟件，在腫瘤最大切面實性區域選擇3個ROI，避開出血、囊變及壞死區域，記錄真擴散系數(true-diffusion coefficient,D)、假擴散系數(pseudo-diffusion coefficient,D*)、灌注分數(perfusion fraction,f)，并取均值。

1.4 細胞學檢測 MR檢查結束后經腹腔注射10%水合氯醛處死荷瘤鼠，完整取出腫瘤放入冰生理鹽水。將腫瘤分為2份。1份放入4%多聚甲醛溶液固定，用于HE染色并采用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)法檢測細胞凋亡：由2名病理科醫師分別按相同標準在偏光顯微鏡下分析病理切片，凋亡細胞為細胞核呈棕黃色，隨機選取5個高倍(×400)視野觀察，計算TUNEL凋亡細胞與細胞總數的百分比，即細胞凋亡指數(apoptosis index,AI)，取2名醫師的均值。另1份放入液氮，行Western Blot檢測P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、多藥耐藥相關蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1,MRP1)、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)表達。采用凝膠圖象處理系統Image J分析條帶的凈光密度值，計算蛋白表達光密度比(relative integrated optical density,RIOD)。

1.5 統計學分析 采用SPSS 13.0統計分析軟件。計量資料以±s表示，2組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，以Spearman分析觀察IVIM參數與腫瘤細胞蛋白表達的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

耐藥組SW480/5-FU細胞IC50為20.59 μg/ml，不耐藥組SW480細胞IC50為4.64 μg/ml，RI=4.44。

不耐藥組腫瘤D值較耐藥組增加(P=0.008)，2組腫瘤D*值、f值差異無統計學意義(P均>0.05)，見表1。

表1 耐藥組與不耐藥組腫瘤D值、D*值、f值比較(±s，n=5)

表1 耐藥組與不耐藥組腫瘤D值、D*值、f值比較(±s，n=5)

組別D(×10-3 mm2/s)D?(×10-3 mm2/s)f(%)耐藥組0.63±0.052.81±0.925.58±1.55不耐藥組0.95±0.185.20±2.367.59±3.47Z值2.6111.7760.940P值0.0080.0950.421

HE染色示2組腫瘤壞死區域范圍相似；耐藥組細胞核較不耐藥組增大，且細胞間排列更緊密，細胞密度較大(圖2)。TUNEL法發現2組均可見散在的細胞核呈棕黃染色的凋亡細胞(圖3)，耐藥組和不耐藥組AI分別為(38.24±5.58)%、(31.42±10.31)%，差異無統計學意義(Z=-1.091，P=0.275)。耐藥組P-gp、MRP1、PKC表達量均較不耐藥組增加，差異均有統計學意義(P均<0.05)，見表2。

表2 耐藥組與不耐藥組蛋白表達RIOD值比較(±s，n=5)

表2 耐藥組與不耐藥組蛋白表達RIOD值比較(±s，n=5)

組別P-gpMRP1PKC不耐藥組0.20±0.03 0.15±0.010.16±0.02 耐藥組0.31±0.080.69±0.100.86±0.06Z值2.6112.7852.668P值0.0030.0050.008

腫瘤D值與P-gp(rs=-0.697，P=0.025)、MRP1(rs=-0.925，P<0.001)、PKC(rs=-0.693，P=0.026)表達均呈負相關。

3 討論

目前腫瘤耐藥性監測多采用體外實驗[3]。但腫瘤組織是分化不均勻的異質性和多形性細胞群體，體外實驗僅能檢測活檢區域腫瘤組織的耐藥情況，不能準確反映其整體耐藥性；且體外檢測只有取得腫瘤標本才可進行，為有創檢查，所需時間較長，腫瘤組織離體后某些代謝物含量會產生改變，最終可能影響實驗結果。因此，探索一種便捷、可靠的方法以活體評價整個腫瘤的耐藥性有重要價值。

圖2 病理圖(HE，×400) A.不耐藥組;B.耐藥組 耐藥組W480/5-FU細胞核較SW480增大，且細胞間排列更緊密

圖3 腫瘤組織細胞凋亡檢測(TUNEL法，×400) A.不耐藥組;B.耐藥組 2組均發現散在細胞核呈棕黃染色的凋亡細胞

DWI可無創進行微觀水平活體成像，準確、快速顯示空間結構和組織成分。組織中水分子擴散能力與組織細胞密度和細胞膜完整性呈負相關，細胞膜不完整或細胞間隙增大時，水分子運動受限程度減低，DWI信號增高[2]。ADC能量化分析可反映活體組織中水分子擴散運動受限程度，及組織構成、功能狀態與微觀結構等變化[4]。本課題組前期研究[5]結果顯示，與不耐藥組移植瘤對比，耐藥組移植瘤ADC值降低(P>0.05)，提示當腫瘤產生耐藥時，其生物學性狀的差異可能導致以上表征改變，并通過水分子交換功能的改變而體現。另外，組織內水分子擴散還受微循環血液灌注等因素影響，而傳統DWI忽略了局部毛細血管網的微循環灌注對ADC值的影響[4-6]。

IVIM模型通過分析多b值DWI圖像而對水分子擴散運動與微循環血液灌注[2]單獨量化，獲得擴散相關參數D值和灌注相關參數D*、f值。D值反映水分子在組織中的流動性,取決于細胞與細胞外空間的曲折度、細胞膜的完整性和流體的黏度[7-10]；D*值反映體素內微循環灌注相關的擴散效應，取決于血流速度和微血管段的長度[11-13]。f為體素內微循環相關的灌注效應占總體擴散效應容積的比值，是微血管血流對DWI信號的相對變化[2,4]。因此，IVIM評價腫瘤耐藥性更具有潛在價值。

IVIM可不受微循環灌注等因素影響而反映相對客觀可信的水分子擴散狀態。擴散系數主要取決于細胞內和細胞外的空間組織比，D值一般被認為與細胞密度呈負相關[2,4,6]。有研究[14]顯示化療后鼻咽癌病灶D值增加，可能是由于化療藥物殺傷腫瘤細胞，導致細胞密度減少所致。本研究不耐藥組移植瘤D值較耐藥組增高(P<0.05)，且與腫瘤耐藥相關蛋白表達呈負相關；腫瘤組學研究顯示2組腫瘤細胞的壞死、凋亡無顯著差別，但耐藥組細胞形態不規則、組織間隙較不耐藥組小，核漿比較不耐藥組增大。推測這是由于親本SW480結腸癌在5-FU反復刺激下腫瘤細胞生物學性狀發生改變，增殖能力增強，細胞核增大，成瘤后細胞密度增加、胞外間隙變窄，導致腫瘤水分子擴散能力減弱，D值降低。細胞密度增大可導致腫瘤血管形成受阻，最終導致腫瘤缺血壞死和酸中毒，致使對化療藥物不敏感；且由于腫瘤血管缺乏化療藥物到達瘤體的“通道”，使瘤內藥物濃度較低。以上機制均可能與腫瘤多藥耐藥相關[15]。

D*值與平均血流速度和平均毛細血管段長度呈正比，而f值較高則提示腫瘤血供較為豐富。血管量也可對腫瘤耐藥性產生影響，理論上血供較多的腫瘤出現缺氧壞死和酸中毒的概率較低，且化療藥物濃度也與腫瘤血供呈正相關。但Koh等[16]發現鼻咽癌放化療有效組及無效組間f值和D*值差異均無統計學意義(P均>0.05)。Hauser等[14]則發現鼻咽癌f值越高，對化療藥物越不敏感，預后反而較差。Che等[17]觀察乳腺癌輔助化療患者，敏感組f值低于非敏感組(P<0.05)，2組D*值差異均無統計學意義(P均>0.05)。本研究耐藥組和不耐藥組f值和D*值差異無統計學意義(P>0.05)，可能由于IVIM成像尚不能反映腫瘤組織毛細血管特性和血流動力學的變化。此外，本研究顯示移植瘤表面可見一層纖維包膜覆蓋，可能對腫瘤血管生長與侵入起阻礙作用，不能完全模擬原位腫瘤的血供特點，這也可能降低了通過f值和D*檢測腫瘤耐藥的敏感度。

總之，與不耐藥組裸鼠人類結腸移植瘤相比，耐藥組D值降低，并與腫瘤耐藥蛋白表達呈負相關，提示D值可能成為活體檢測腫瘤耐藥性的分子標記物。