HPLC法測定去炎酊中游離大黃素和大黃酚的含量

曲靖市中醫醫院，云南 曲靖 655000

去炎酊是由重樓、大黃、紅花、白芷、虎杖、紫草、草烏、獨定子、馬錢子、生南星、苦參等中藥經滲漉制成的酊劑。有清熱除濕、瀉火解毒、活血化瘀、消腫止痛、消炎排膿之功效，主治跌打損傷、外傷感染、癰疽、瘡癤、蚊蟲叮咬、皮膚癢疹等。大黃為方中君藥，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經、利濕退黃，用于實熱積滯便秘、血熱吐衄、目赤咽腫、癰腫疔瘡、腸癰腹痛、瘀血經閉、產后瘀阻、跌打損傷、濕熱痢疾、黃疸尿赤、淋證，水腫，外治燒燙傷；虎杖具有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰，用于實熱黃疸、淋濁、帶下、風濕痹痛、癰腫瘡毒、水火燙傷、經閉、癥瘕、跌打損傷、肺熱咳嗽[1]。現代藥理研究表明，大黃有瀉下、興奮胃腸平滑肌、對消化道黏膜保護、抗病原微生物及抗炎、保護心腦血管、抗腫瘤、保肝利膽等[2]作用；虎杖有抗炎、抗病毒、抗菌、調血脂、抗血栓、改變血流變、擴張血管、保護心肌、抗氧化、抗腫瘤、改善阿爾茨海默病癥狀及預防艾滋病等[3]作用。去炎酊現行質量標準簡單，沒有對處方中任何一味中藥進行含量測定。本文參照中國藥典[1]及文獻[4-12]，建立了HPLC法測定去炎酊中游離大黃素和大黃酚含量的方法,為去炎酊的質量標準提升提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC-20AT型高效液相色譜儀(配有四元泵，自動進樣器，紫外檢測器，柱溫箱，真空在線脫氣機，LC solution工作站)(株式會社島津制作所)，AE240型電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 材料 去炎酊(曲靖市中醫醫院，批號: ZD2017040，ZD2017041，ZD2017042，ZD2017043，規格：60 mL/瓶)；大黃素對照品(批號:110756-201512，含量：98.7%)、大黃酚對照品(批號:110796-201520，含量：99.2%)，以上對照品均購置于中國食品藥品檢定研究院；乙腈(德國默克公司)為色譜純；水為雙蒸水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取大黃素和大黃酚對照品適量，用乙醇制成每1 mL分別含大黃素和大黃酚423.020和176.183 μg/mL的對照品溶液儲備液，精密量取對照品儲備液1 mL，置10 mL容量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得對照品使用液。

2.1.2 供試品溶液 精密量取已搖勻的去炎酊10 mL，置25 mL容量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得供試品溶液。

2.1.3 陰性樣品溶液 按處方比例及制法，制得不含大黃和虎杖的陰性樣品。按“2.1.2”項下方法制成陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件 色譜柱：依利特C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫為30 ℃；流動相：0.1%磷酸溶液-甲醇 (25∶75)；流速為1.0 mL/min；檢測波長為254 nm；進樣量：10 μL。

2.3 線性關系考察 分別精密吸取“2.1.1”項下的對照品儲備液0.2、0.5、1.0、2.5、5.0 mL分別置10 mL容量瓶中, 加60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得標準系列。分別取10 μL進樣，記錄峰面積。以質量濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，進行線性回歸，分別得大黃素和大黃酚回歸方程為Y=36 418X-58 243，r=1.000 0(n=5)和Y=59 776X-39 442，r=1.000 0(n=5)。結果表明，大黃素和大黃酚的質量濃度在分別在8.460 4～211.510 0和3.523 7～88.091 5 μg/mL的范圍內與對應峰面積呈良好的線性關系。混合對照品、供試品及陰性樣品的色譜圖如圖1所示。

2.4 專屬性試驗 吸取“2.1”項下的3種溶液，在“2.2”項下的色譜條件測定，結果樣品在與對照品保留時間相應位置上，有相應的色譜峰，陰性樣品在與對照品保留時間相應位置上，沒有相應的色譜峰，表明陰性樣品不干擾測定。

2.5 精密度試驗 精密吸取“2.1.1”項下的對照品使用液，在“2.2”項下的色譜條件，連續進樣6次，記錄峰面積。結果，大黃素和大黃酚的RSD分別為0.23%和0.22%,表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 取同一批樣品(批號：ZD2017040)6份，每份10 mL，按“2.1.2”項下制備，在“2.2”項下的色譜條件測定大黃素和大黃酚的含量，其含量的RSD分別為0.45%和0.51%。

2.7 穩定性試驗 取“2.1.2”項下制備的同一樣品，室溫下放置，分別以0，2，4，8，16，24，36 h時，在“2.2”項下的色譜條件測定，記錄峰面積。結果，大黃素和大黃酚的RSD分別為0.55%和0.60%,表明樣品36 h內穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密量取已測定含量的去炎酊 (批號：ZD2017040)6份，每份5 mL，置25 mL容量瓶中，精密加入對照品儲備液1.3 mL，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。在“2.2”項下的色譜條件測定，測得大黃素和大黃酚的加樣回收率見表1。

2.9 樣品測定結果 取4批去炎酊，按“2.1.2”項下的方法制備，在“2.2”項下色譜條件測定含量。結果見表2。

表1 加樣回收率試驗結果 (n=6)

表2樣品含量測定結果 (mg/mL，n=2)

批號大黃素大黃酚ZD20170400.120 40.041 5ZD20170410.119 80.041 1ZD20170420.119 70.041 1ZD20170430.120 00.041 5

3 討論

3.1 檢測指標的選擇 大黃和虎杖的主要成分是蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚，中國藥典[1]也是選擇上述5成分作為定量指標，但從樣品測定結果看蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素甲醚含量相對較低，用作定量指標誤差偏大，所以參考文獻[4-8,12]，選擇大黃素和大黃酚為大黃及虎杖的質量控制指標。

3.2 樣品提取溶劑及方法的選擇 由于樣品是酊劑，是60%的乙醇溶液，根據大黃素和大黃酚在乙醇中溶解度相對高些，并結合樣品的制法，選擇用60%乙醇作為提取溶劑，因為此樣品為溶液，所以不需要長時間提取，實際上只要搖勻即可，經試驗，振搖5 min的提取方法，就能滿足回收率要求，而且簡單易行。

3.3 檢測波長的選擇 分別取大黃素、大黃酚對照品的60%乙醇溶液在200～550 nm范圍內進行紫外掃描，大黃素在221、254、289 nm處有最大吸收，大黃酚在225、257 nm處有最大吸收。用221 nm或225 nm的波長時，雜質干擾峰偏多，用289 nm的波長時，大黃酚的響應值偏低，參照中國藥典[1]及文獻[4-8,10-12]，并綜合其他波長處雜質干擾峰的情況，將檢測波長定為254 nm比較合適。

3.4 流動相的選擇 試驗過甲醇-水系統和乙腈-水系統，但色譜峰有些拖尾，參照中國藥典[1]及文獻[4-11]，將水換成0.1%磷酸溶液，峰形變好，最后確定為0.1%磷酸溶液-甲醇系統，經過對流動相比例進行反復調整，發現當流動相為0.1%磷酸溶液-甲醇(25∶75)時，分離良好，且分析時間適宜，最終確定為0.1%磷酸溶液-甲醇(25∶75)為本實驗流動相。

3.5 方法適用 大黃素和大黃酚有游離型與結合型兩種形態，因為本方法沒有進行加酸水解，只能測定游離型的大黃素和大黃酚，要測定總的大黃素和大黃酚需要加酸水解將結合型的大黃素和大黃酚游離出來才能測定，所以需要加酸水解-加熱回流-液液萃取3個環節才能完成，操作繁瑣，測定游離型的大黃素和大黃酚也能有效控制本制劑中大黃和虎杖的質量。

4 結論

去炎酊現行質量標準修檢驗項目缺少定量檢測方法。本文根據去炎酊組方工藝特點，參考相關文獻，選擇大黃素、大黃酚作為質量控制指標，用C18色譜柱，在254 nm波長處進行檢測，柱溫30 ℃，用0.1%磷酸溶液-甲醇(25∶75)為流動相，控制流速為1.0 mL/min，結果大黃素和大黃酚在各自濃度范圍內均呈現良好的線性關系，精密度、重復性、穩定性、平均加樣回收試驗結果符合要求。該方法專屬性強、簡單易行、節約時間和成本，可用于測定去炎酊中游離大黃素和大黃酚的含量。