靈芝及其產品中麥角甾醇物質的測定方法

1. 湛江中醫學校，廣東 湛江 524094;2. 廣東省微生物研究所，廣東 廣州 510070

靈芝為多孔菌科真菌赤芝GauodermaLucidum(Leyss. ex Fr.)Karst.或紫芝GauodermasinenseZhao Xu et Zhang的干燥子實體，具有補氣安神、止咳平喘之功效[1]。靈芝是傳統的名貴滋補中藥，也是常見的保健食品，具有很高的經濟價值。隨著生活水平的提高，越來越多的消費者喜愛購買靈芝及其相關產品保健養生，尤其腫瘤病患者，更是樂于購買這些產品作輔助治療。靈芝及其相關產品產量雖大但監管依據未健全，若沒有有效的質量標準，靈芝及其加工品很難從外表判斷其質的優劣，若不法商家以次充好，輕則給消費者造成經濟損失，重則加重了原有的病情而危及人身安全，因此建立靈芝及其相關產品有效的質量控制方法是非常有必要的[2]。

目前行業內公認的傳統功校驗證指標尚顯粗放，缺乏對靈芝及其相關產品的質量控制方法。因麥角甾醇類是菌類植物中特有成分，具有調節新陳代謝、調節激素水平、預防心血管疾病等功能，且在靈芝及其相關產品中含量較高，可作為評價靈芝及其相關產品質量的有力質量控制指標。故本研究建立了HPLC測定靈芝及其產品中麥角甾醇含量的方法，以期為靈芝及其產品的質量控制提供有效方法和檢驗依據[3-4]。

1 儀器與材料

1.1 儀器 安捷倫高效液相色譜；電子天平；水浴鍋；旋轉蒸發儀；循環水式真空泵；超聲波清洗器。

1.2 材料 色譜純甲醇；去離子純凈水；95%乙醇；分析純石油醚。

麥角甾醇對照品購于中國藥品生物制品檢定所；靈芝及其相關產品均由廣東粵微食用菌技術有限公司提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件[4-5]色譜柱：Agilent prep-C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm )；流動相：98%純甲醇；檢測波長：282 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：28 ℃；進樣量：20 μL；外標法測定。

2.2 對照品溶液的制備 麥角甾醇標準工作液：精密稱定麥角甾醇對照品10 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻超聲，即得(每1 mL中含麥角甾醇0.2000 mg)。

2.3 供試品溶液的制備[6]靈芝提取物溶液：取本品1.0 g(n=3)，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇溶解，超聲處理60 min，取出，放冷，用甲醇補足減失的質量，過濾，取濾液過0.45 μm微孔濾膜，置4 ℃冰箱保存。孢子油溶液：取靈芝袍子油0.5 g(n=3)，精密稱定，置10 mL量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得，過0.45 μm微孔濾膜，置4 ℃冰箱保存。

靈芝菌絲體/靈芝子實體/靈芝孢子粉/全靈芝孢子粉溶液：精密稱取樣品1.0 g(n=3)，加95%乙醇50 mL，恒溫85 ℃水浴，回流1 h，過濾，于殘渣中分別按上面方法提取3次，合并濾液，減壓濃縮，用甲醇定容至10 mL，搖勻，0.45 μm濾膜過濾，置4 ℃冰箱保存。

2.4 供試品溶液制備方法的優選[7-8]

2.4.1 提取方法的選擇 取干燥靈芝子實體1 g，用95%乙醇浸泡過夜，濾出上清液；殘渣中加95%乙醇后超聲30 min或85 ℃回流1 h，過濾合并濾液，濃縮，定容至10 mL，過0.45 μm濾膜，進樣分析。實驗結果表明，采用回流提取方法測得的麥角甾醇含量高于超聲提取方法，故本實驗采用回流提取。見表1。

表1 提取方法試驗結果

2.4.2 提取溶劑的選擇 取干燥靈芝子實體1 g，分別用甲醇、95%乙醇、石油醚等不同溶劑，以上述回流方式處理，結果表明采用甲醇為提取溶劑的麥角甾醇提取量最高，乙醇提取略次之，考慮到用乙醇的毒性及成本均低于甲醇，故選擇乙醇為提取溶劑。見表2。

表2 不同溶劑回流提取試驗結果

2.4.3 正交實驗比較回流所用的料液比、提取次數及提取時間的組合選擇 選取料液比、提取次數及提取時間作為考察因素，分別記為因素A、因素B和因素C，作三因素三水平正交試驗。取干燥靈芝子實體1 g，用95%乙醇浸泡過夜，濾出上清液；殘渣中加95%乙醇后按正交設計的方法在85 ℃進行回流，過濾合并濾液，濃縮，定容至10 mL，過0.45 μm濾膜，進樣分析。見表3、表4和表5。

表3 L9正交實驗因素與水平設計

表4 正交實驗結果

表5 正交實驗結果的方差分析表

討論：使用軟件“正交設計助手”對正交數據進行方差分析，結果表明各因素對綜合評分的影響都無顯著性意義。極差分析表明，因素A(料液比)為主要影響因素，其次是提取次數因素，各因素作用主次順序為A>B>C，通過綜合考慮確定，最佳方法為A3B3C1，即料液比為1∶50，提取3次，每次回流1 h。

2.5 標準曲線與線性范圍[9-10]分別精密吸取對照品貯備液溶液10, 8, 4, 2,1 mL置于10 mL容量瓶中。加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得不同濃度對照品溶液。過0.45 μm微孔濾膜后分別吸取20 μL標品溶液注入液相色譜儀。以峰面積(x)為橫坐標，對照品麥角甾醇的進樣量(y)為縱坐標，得線性回歸方程。線性回歸方程為：y=13.32x-24.32 ，r=0.9997，結果表明麥角甾醇在20-200 μg/mL呈良好的線性關系。定量限設定為20 g/mL，最低檢出限視所用儀器信噪比而定，一般為信噪比的2～10倍，本標準檢測限位0.2 g/mL，與目前國內文獻檢測限相比，具有一定優勢。色譜圖如圖1所示。

2.6 樣品含量測定 按2. 3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進行含量測定，根據樣品測定的色譜峰面積，以外標法計算樣品中麥角甾醇的含量，計算公式:X= C×V/(M×1 000)，式中: X為試樣中游離麥角甾醇的含量(mg/g);C為游離麥角甾醇的質量濃度(g/ mL); V為試樣定容體積(mL); M為試樣的質量(g)。測定結果見表6。

表6 試樣測試結果

2.7 方法性能指標考察[11]

2.7.1 精密度試驗 精密吸取麥角甾醇對照品浴液(0.2 000 mg/mL) 20 μL，連續進樣6次，分別測定其峰面積值，計算峰面積積分值RSD為0.5%, 表明該儀器精密度良好。

2.7.2 重復性試驗 精密稱量樣品6份，按1.3項方法制備，進樣20 μL，測定其峰面積值，計算峰面積積分值的RSD為1.2%，表明該方法重復性良好。

2.7.3 穩定性試驗 將樣品溶液在室溫下貯存,每間隔0、2、4、8、12、24 h各進樣20 μL，測定其峰面積，RSD為1.08%，說明樣品溶液在24 h內穩定。

2.7.4 加樣回收率試驗 精密稱取己知含量的供試品，分別加入麥角甾醇標準品1.90 mg、2.40 mg、2.80 mg，按照上述樣品的制備和分析步驟測定其峰面積值，計算回收率。見表7。

由表7可知，麥角固醇的回收率在98.50%～99.93%之間，表明回收良好，此方法穩定可靠，適宜于靈芝及其相關產品中麥角固醇含量的測定。

表7 加樣回收率試驗結果

3 結論

本研究建立的HPLC 測定麥角甾醇含量的方法，能準確地測定靈芝及其相關產品中該成分的含量。經過精密度實驗、重復性實驗、穩定性實驗、回收率實驗驗證，該方法均符合測定要求。該方法操作簡便，穩定性好，重現性高，特異性強，可作為靈芝及其產品中麥角甾醇的有效測定方法和質量控制標準，對于其他真菌的麥角甾醇含量測定與質量評價方法的建立也有參考價值和依據。