清熱除濕止痛液的提取工藝研究

潘從澤 李喜香 董云霞2 馮彥俊

1甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050；2 蘭州市肺科醫院，甘肅 蘭州 730050

清熱除濕止痛液是甘肅省中醫院協定處方制劑，由秦艽、忍冬藤、防己等十味中藥組成，具有清熱除濕，通絡止痛的功效，用于治療風濕性、類風濕性關節炎、痛風性關節炎，強直性脊柱炎、肩周炎、頸椎病等屬風濕熱痹、出現關節疼痛，局部紅腫灼熱等癥。歷經多年臨床應用效果明顯，可顯著改善風濕熱痹型膝骨關節炎患者關節疼痛、活動受限、局部腫脹，發熱等局部和全身癥狀[1]。現擬將傳統湯劑改為便于服用的合劑，對其提取工藝進行研究，轉化為醫院制劑，更好的為臨床服務。方藥中秦艽為祛風濕熱藥，指標成分為龍膽苦苷，具有鎮靜、鎮痛、解熱、抗炎等作用[2-4]。本實驗采用正交試驗，以龍膽苦苷為評判指標，對清熱除濕止痛液進行提取工藝優化，找到最佳提取條件，對實際生產有一定指導意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters 2695型HPLC儀，Waters 2998型光電二極管陣列檢測器(美國Waters公司)；ABT100-5M電子天平(KERN德國)；MH-5000型可調式電熱套(武漢格萊莫檢測設備有限公司)；AKRY-UP-1816超純化水機(成都唐氏康寧科技發展有限公司)；RE 5298A旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；SB-5200DTR超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 材料 秦艽、忍冬藤、防己等十味藥材均購于蘭州安泰堂中藥飲片有限公司，經甘肅省中醫院李喜香主任中藥師鑒定，符合2015版《中國藥典》藥材項下規定；龍膽苦苷對照品(批號110770-201716，中國食品藥品檢定研究院)，甲醇為色譜純(批號20171204，天津市福晨化學試劑廠)，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 含量測定[4-7]

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters Symm-etry-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇：水=30∶70；流速1.0 mL/min；檢測波長：274 nm；柱溫：25 ℃。在上述色譜條件下，理論板數以龍膽苦苷峰計應不少于4 000，分離度>1.5，龍膽苦苷對照品、清熱除濕止痛液供試品及陰性樣品色譜圖見圖1。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取龍膽苦苷對照品1.08 mg置于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻。

2.1.3 供試品溶液的制備 按處方比例稱取9份含秦艽、忍冬藤、防己等十味藥材的混合飲片(78 g)，按擬定的正交試驗設計進行水煎煮提取，濾過后濃縮至適量，加入乙醇，使含醇量達55%，靜置16小時，抽取上清液，回收乙醇至無醇味，加純化水至100 mL，得到清熱除濕止痛液。精密量取10 mL清熱除止痛液置于100 mL容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，微孔濾膜濾過，濾液即為供試品溶液。

2.1.4 陰性樣品溶液的制備 按清熱除濕止痛液處方和制備工藝制備缺秦艽的陰性樣品，按“2.1.3”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.1.5 線性關系的考察 分別精密吸取“2.1.2”項下對照品溶液2.5、5、10、15、20 μL，按上述色譜條件依次進樣，以進樣量(μL)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。其線性回歸方程為：y=1 727.834 38x+15.004 19，r=0.999 94(n=5)線性范圍：0.52～4.16 μg。

2.1.6 精密度試驗 精密吸取“2.1.2” 項下對照品溶液10 μL，按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果，龍膽苦苷峰面積的RSD為1.24%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩定性試驗 精密吸取“2.1.3” 項下供試品溶液10 μL，分別與放置在0、2、6、10、14、24 h時進樣測定，記錄峰面積。結果，龍膽苦苷峰面積的RSD為1.39%(n=6)，表明樣品溶液在24 h內穩定。

2.1.8 重復性試驗 按處方比例稱取處方藥材78 g，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，龍膽苦苷峰面積的RSD為1.71%(n=6)，表明本方法重復性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 按處方比例稱取秦艽、忍冬藤、防己等十味藥材混合飲片39 g，平行9份，平均分為3組，每組分別按清熱除濕止痛液中龍膽苦苷含量的80%，100%，120%精密加入龍膽苦苷對照品，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，共9份，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率。結果，平均加樣回收率為99.48%，RSD=1.67%(n=9)，表明該方法可行。結果見表1。

表1 龍膽苦苷加樣回收試驗結果 (n=9)

2.2 正交試驗 以提取時間(A)、加水倍量(B)、空白(C)及提取次數(D)為考察因素[8-9]，以龍膽苦苷含量為指標，按正交L9(34)進行試驗，因素水平、正交試驗設計及結果和方差分析分別見表2、表3和表4。

表2 因素水平表

表3 L9(34)正交試驗設計及結果

表4 方差分析結果

注：F0.05(2，2)=19.00，F0.01(2，2)=99.00

由極差分析結果可以得出，各因素對龍膽苦苷含量影響的大小順序為： A(提取時間)>B(加水倍量)>D(提取次數)，其最佳工藝為A2B1D2。

由方差分析結果可知，提取時間(A)和加水倍量(B)差異均有顯著統計學意義(P<0.01)，而提取次數(D)差異無統計學意義(P﹥0.05)。考慮到藥材的提取效果，確定提取次數為3倍，得出最佳提取工藝為A2B1D3，即加水量8倍，提取3次，每次提取50 min。

2.3 驗證試驗 按照最佳提取工藝A2B1D3分別提取三批處方量藥材進行驗證試驗，按照“2.1.3” 項下方法測定龍膽苦苷的含量，取平均值，結果優于或近似于正交試驗的數據。驗證結果見表5。

表5 驗證試驗結果

3 討論

清熱除濕止痛液是由秦艽、忍冬藤、絡石藤、桑寄生、薏苡仁等10味中藥制成的復方制劑，其中秦艽為君藥，傳統用于風濕痹痛、筋脈拘攣、骨節酸痛等病癥，廣泛用于風濕病的治療，在本院治療膝骨關節炎疾病的眾多案例中，取得了良好的臨床效果[1]。秦艽藥材中的主要成分以龍膽苦苷為主的裂環環烯醚萜苷類化合物，而龍膽苦苷為其指標性成分[10]，選其為含量測定指標，且對清熱除止痛液質量標準的進一步研究有一定的參考作用。

本實驗通過正交試驗設計對清熱除濕止痛液提取工藝進行優化篩選，通過測定龍膽苦苷的含量來評價其內在質量，確定了最佳的提取工藝為加水量8倍，提取3次，每次提取50 min，適合實際生產，可作為后續研究的基礎和參考。