喘可治注射液對甲型H1N1流感病毒FM1株感染免疫低下小鼠肺炎的影響

1.中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京 100700；2.華北理工大學中醫(yī)學院，河北 唐山 063210；3.北京中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，北京 100029

甲型H1N1流感病毒最早于2009年4月在墨西哥爆發(fā)[1]，隨即在全球范圍內(nèi)蔓延。世界衛(wèi)生組織初始將此型流感稱為“人感染豬流感”，后將其更名為“甲型H1N1流感”。2009年6月11日，世界衛(wèi)生組織將甲型H1N1流感警戒提升為6級，同年，中國明確將甲型流感病毒H1N1納入乙類傳染病，并采取甲類傳染病的預防和控制措施[2]。流感病毒具有易變異性和易傳染性，免疫力低下的人群更易受到攻擊[3]，因此，探尋兼具調(diào)節(jié)機體免疫功能的抗流感性肺炎藥物顯得尤為重要。喘可治注射液由淫羊藿、巴戟天組成，具有抗過敏、增強體液免疫與細胞免疫的功能，研究發(fā)現(xiàn)喘可治注射液還表現(xiàn)出一定的抗炎作用，可以減少細胞炎性因子TNF-α、IL-β、IL-18等的分泌，減輕大鼠肺葉局部炎癥反應(yīng)[4]。本研究通過建立免疫低下病毒性肺炎動物模型，對喘可治注射液防治流感的藥效學作用進行評價。

1 材料

1.1 動物及病毒株 ICR小鼠，SPF級，體重(14±1)g，雌雄各半，購自北京維通利華試驗動物技術(shù)有限公司，許可證編號：SCXK(京)2006-0009。甲型H1N1流感病毒鼠肺適應(yīng)株(FM/1/47株)，購自中國疾病預防控制中心病毒病預防控制研究所，由本所ABSL-2試驗室傳代，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 藥品及試劑 喘可治注射液，廣州健心藥業(yè)有限公司，國藥準字Z20010172，批號20080905059，規(guī)格2 mL/支；達菲(磷酸奧司他韋膠囊)，瑞士巴塞爾豪夫邁·羅氏有限公司產(chǎn)品，上海羅氏制藥有限公司分裝，批號B1162，分裝批SH0033;注射用環(huán)磷酰胺：批號20090103，山西普德藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；乙醚，北京試劑公司產(chǎn)品，批號20090707。

1.3 儀器 Applied Biosystems 7500型定量PCR儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI)公司產(chǎn)品；TC-96/G/H(b) 梯度PCR儀，博日科技有限公司產(chǎn)品；HC-3018R高速冷凍離心機，中科中佳公司產(chǎn)品；MSC1.8型A2型生物安全柜，德國Thermo產(chǎn)品；YP/0001型動物體重電子天平，上海越平科學儀器有限公司產(chǎn)品；AR1140型動物臟器電子天平，美國Chaus產(chǎn)品。

2 方法

2.1 給藥劑量設(shè)計 喘可治注射液成人臨床常規(guī)用量為8 mL/60 kg/d，試驗時小鼠用量為1.5 mL/kg/d(相當于人臨床用藥量的等效劑量)，試驗時按等容不等濃0.2 mL/10 g腹腔注射給藥。達菲臨床用量為150 mg/60 kg，換算為小鼠等效劑量為27.5 mg/kg/d，按0.2 mL/10 g灌胃給藥。

2.2 病毒株處理甲型H1N1流感病毒(FM1株)，本室常規(guī)雞胚傳代，TCID50為1×10-4.5，-80 ℃冰箱保存。

2.3 流感病毒H1N1感染致小鼠肺炎模型 除正常對照組外，其余組小鼠按10 mL/kg皮下注射環(huán)磷酰胺(10 mg/kg)，每日1次，共2天，造成免疫低下模型[5]。除正常對照組、環(huán)磷酰胺組外，其余組小鼠用乙醚輕度麻醉，以15個LD50病毒液(FM1株)滴鼻感染，每只35 μL，造成免疫低下病毒性肺炎小鼠模型[3]。

2.4 分組及給藥 ICR小鼠隨機分為5組，分別為正常對照組、環(huán)磷酰胺對照組、模型對照組、達菲對照組(灌胃給藥)、喘可治注射液組(腹腔注射給藥)，每組10只。治療性實驗：感染當天開始給藥，每天1次，連續(xù)4 d，第5天后稱重，處死小鼠，檢測各指標。預防實驗：各組給予相應(yīng)的藥物，每天1次，連續(xù)5 d，給藥第5天后，除正常對照組外，其它組小鼠用乙醚輕度麻醉，以15個LD50流感病毒液FM1株滴鼻感染，感染第4天后，稱重，處死小鼠，檢測各指標。

2.5 引物設(shè)計與合成 引物設(shè)計：利用Primer Premier 5.0軟件進行序列分析并設(shè)計引物，所設(shè)計引物的Tm值、GC含量及3′末端穩(wěn)定性等基本參數(shù)依據(jù)引物優(yōu)化原則。

引物合成：由上海英駿公司合成。針對流感病毒(H1N1)基因序列的上下游引物序列見表1。

表1 引物序列

2.6 Real-time RT-PCR擴增 用液氮研磨肺組織后，使用Trizol提取肺組織中的RNA，用上述H1N1和GAPDH引物進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)，反應(yīng)體積為20 μL，反應(yīng)體系含樣本RNA 2 μL。反應(yīng)條件為：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后分析各檢測樣本Ct值。

2.7 計算方法 肺指數(shù)=肺濕重(g)/體重(g)；脾指數(shù)=脾濕重(g)/體重(g)；胸腺指數(shù)=胸腺濕重(g)/體重(g)；肺指數(shù)抑制率=(病毒對照組平均肺指數(shù)-實驗組平均肺指數(shù))/(病毒對照組平均肺指數(shù)-正常對照組平均肺指數(shù))×100%。

病毒載量計算方法：使用相對定量的方法，以GAPDH作為內(nèi)對照，選擇一個樣品(Con)作為 Calibrator，計算方法如下：

ConΔCt=Con Ct-Con GAPDH Ct

樣本ΔCt=樣本Ct-樣本GAPDH Ct

樣本ΔΔCt=樣本ΔCt-ConΔCt

2-ΔΔCt是各處理組基因表達相對Calibrator的倍數(shù)改變。

相對含量的變化=2-ΔΔCt×100%

病毒載量抑制率=(病毒對照組病毒載量均值-實驗組病毒載量均值)/病毒對照組病毒載量均值×100%。

3 結(jié)果

3.1 喘可治注射液對甲型流感病毒H1N1感染免疫低下小鼠肺炎模型的治療作用 甲型H1N1流感病毒FM1株感染免疫低下小鼠后，肺指數(shù)增高，脾、胸腺指數(shù)降低，三者與環(huán)磷酰胺組比較差異均有顯著性意義(P<0.01)。達菲對照組肺、脾、胸腺指數(shù)與模型對照組比較差異均有顯著性意義(P<0.01)。喘可治注射液組脾、胸腺指數(shù)升高，脾指數(shù)與模型對照組比較有顯著性意義(P<0.05)；喘可治注射液組肺指數(shù)有所降低，但與模型對照組比較無顯著性意義(P>0.05)。

表2 喘可治注射液對FM1株流感病毒免疫低下小鼠肺炎的治療作用

注：與環(huán)磷酰胺對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型對照組比較，**P<0.01

3.2 喘可治注射液對甲型流感病毒H1N1感染免疫低下小鼠肺炎模型的預防作用 采用甲型H1N1流感病毒FM1株感染免疫低下小鼠后，肺指數(shù)明顯增高，與環(huán)磷酰胺對照組比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；感染前預防性給予臨床等效劑量的喘可治注射液4 d，可明顯降低肺指數(shù)，與模型對照組比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

預防性給預喘可治注射液可明顯降低小鼠肺組織中FM1株流感病毒病毒載量，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，病毒載量抑制率可達58.68%。

表3喘可治注射液對FM1株流感病毒感染免疫低下小鼠肺炎的預防作用

組別劑量肺指數(shù)抑制率/%病毒載量抑制率/%正常對照組-0.62±0.06---環(huán)磷酰胺對照組-0.70±0.07---模型對照組-1.56±0.50##-1517839.97±391122.94-達菲對照組27.5mg/kg1.10±0.18**54.13376923.34±26710.71**75.17喘可治注射液1.5mL/kg0.93±0.18**73.59627217.53±31385.04**58.68

注：與環(huán)磷酰胺對照組比較，##P<0.01；與模型對照組比較，**P<0.01。

4 討論

環(huán)磷酰胺是目前臨床常用的一類經(jīng)典廣譜抗腫瘤藥物，但其有明顯的細胞毒性，治療過程中往往會殺傷體內(nèi)增生活躍的免疫細胞，致使機體免疫低下，甚至免疫紊亂[5]，因此，該藥常常被用來制備免疫低下動物模型。應(yīng)用環(huán)磷酰胺造成免疫低下小鼠模型，操作簡便，是動物實驗中比較常用的一種方法[6-7]。甲型H1N1流感病毒屬于正粘病毒科A型流感病毒，攜帶有H1N1亞型豬流感病毒毒株包含禽流感、豬流感及人流感三種流感病毒的核糖核酸基因片斷，盡管不同亞型之間可以組成很多種流感病毒血清型，但是可造成人感染豬流感病毒的血清型主要有H1N1、H1N2和H3N2[8]，其中H1N1占的比例最大，因此，本實驗采用甲型H1N1流感病毒FM1株感染免疫低下動物造成肺炎模型。

當流感病毒在肺臟支氣管上皮細胞和肺組織中大量增殖時，可引起嚴重的病理組織損傷，如肺部水腫、炎性滲出、充血等，導致支氣管炎和間質(zhì)性肺炎[9-10]，這些病理改變均可使肺臟重量增加，肺指數(shù)值越大，表示肺組織病變程度越嚴重，因而，肺指數(shù)可用來評價肺組織病變程度。而對病毒載量相對定量的分析，可表現(xiàn)出病毒復制動力學[11]，也反映肺組織中病毒的濃度，是病毒增殖和免疫清除機制共同作用的結(jié)果[12]，因而，在判定疾病進程和臨床治療效果上具有極大的價值[3]。

本研究成功建立了流感病毒感染免疫低下小鼠肺炎模型，以肺指數(shù)和病毒載量為評價指標，觀察喘可治注射液對甲型H1N1流感病毒FM1株感染免疫功能低下小鼠的防治作用，并與我國衛(wèi)生部推薦的治療流感主要藥物達菲進行了比較研究，實驗結(jié)果顯示，治療性給予喘可治注射液后，小鼠脾指數(shù)則升高明顯，與模型對照組比較有顯著性差異(P<0.01)，小鼠肺指數(shù)雖有明顯的降低趨勢，但與模型對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。預防性給予喘可治注射液后，肺指數(shù)及肺組織中毒病毒載量均明顯降低，與模型對照組比較有顯著性差異(P<0.01)，病毒載量抑制率達58.68%。以上數(shù)據(jù)證實，喘可治注射液對甲型H1N1流感病毒有明顯的抑制或殺滅作用，同時還具有免疫調(diào)節(jié)作用，可改善和提高機體的免疫功能，對感病毒感染免疫低下小鼠肺炎模型防治作用明顯。本研究為其臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù)，為今后免疫低下病毒性肺炎的藥效評價和免疫致病機制研究提供方法學參考。