量子點標記免疫層析技術檢測布魯氏菌病的方法研究

王升啟榮 振王素華姜 海

布魯氏菌病是一種世界范圍內常見的人獸共患疾病，全世界每年有超過50萬例新發病例診斷為布魯氏菌病[1]。該病給養殖生產者和國家造成嚴重的經濟損失，作為生物恐怖病原被一些西方國家用作生物戰劑[2]，危害國家安全和人民健康。近年來，布魯氏菌病的疫情出現回升趨勢，并且引發嚴重的公共衛生問題。傳統鑒定布魯氏菌方法主要以試管凝集試驗(SAT)和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)為主。隨著科學技術的發展，一些新的方法技術被用到布魯氏菌的檢測中來[3-4]。而以膠體金為標記物的免疫層析方法(GICA)，因操作簡單、結果易判讀、血清用量少、成本低、無需專業技術人員以及專業設備等優點，廣泛應用于布魯氏菌病的現場檢測。量子點(Quantum dots，QDs)作為一種新型的熒光標記材料，因其具有較好的熒光特性，廣泛應用于發光生物探針領域量，以用來提高檢測靈敏度[5-7]。相較于膠體金免疫層析法，量子點免疫層析技術的應用前景也非常廣闊。因此，本研究將量子點代替膠體金，開發一種量子點免疫層析技術，以檢測血清中的布魯氏菌抗體。

1 材料和方法

1.1材料及儀器 硝酸纖維素膜(nitrocellulose membrane，NC膜,型號：HF13502S25)；玻璃纖維素膜(型號：Ahlstrom8964)；血清樣品墊(型號：XQ-Y2)；吸水紙(型號：H5072)；PVC底板(型號：DB-6)，以上均購自上海杰一生物技術有限公司；劃膜儀(型號：XY1000，Bio-Dot公司)；微電腦自動斬切機(型號：ZQ2000，上海金標生物科技公司)；高功率數控超聲清洗儀(型號：KQ-800KDE)；冷凍干燥機(型號：LGJ-10B，北京四環科學儀器廠)；全系列德國eppendorf離心機(型號：C5424)；數控裁條機(型號：CTS300，上海金標生物科技有限公司)。

1.2試劑 牛血清白蛋白(BSA)，含吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)，2-嗎啉乙磺酸溶液(Mercaptosuccinicacid，MES)；N-羥基琥珀酰亞胺 (N-hydroxysuccinimide，NHS)；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，Sigma公司)；量子點(QDs，表面活性基團為羧基，購自于NanoGen公司)；布魯氏菌全菌蛋白(由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所提供)；蛋白A(staphylococcal protein A，SPA，Sigma公司)，其他試劑均為分析純。試驗中所用水(18.2MΩ)由Milli-Q純水系統提供。

1.3樣本來源 布魯氏菌病病人陽性血清、布魯氏病國家標準陽性血清、正常人陰性血清由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所提供，含炭疽、霍亂抗原血清由軍事醫學研究院輻射醫學研究所分子診斷實驗室提供。

1.4 方 法

1.4.1量子點的偶聯及包被 取25 μL QDs，加5 μL 0.1 mol/L pH6.0 MES和20 μL去離子水洗滌；加入一定量的交聯劑NHS 、EDC 37 ℃下活化30 min；反應結束后離心棄上清液，加入10 mol/L MES的溶液重懸至量子點原始體積，加入一定量的布魯氏菌全菌蛋白溶液充分反應，使用BSA進行封閉，待封閉完成離心后棄去上清液，根據需要稀釋至合適濃度均勻噴涂在釋放墊上，冷凍干燥3～4 h。

1.4.2硝酸纖維素膜的包被 將SPA和布魯氏菌全菌蛋白稀釋至所需濃度，分別作為C線(質控線)和T線(檢測線)，將膜置于相對濕度20%，溫度37 ℃條件下干燥2.5～3 h。

1.4.3試紙條的組裝 將樣品墊、釋放墊、層析膜、吸收墊相互重疊1～1.5 mm粘貼在PVC底板上。其中樣品墊和結合墊為玻璃纖維素膜，層析膜采用硝酸纖維素膜，吸水紙采用吸水濾紙，試紙條結構見圖1。將組裝好的試紙條切割成長6.5 cm、寬3.5 mm，加入干燥劑后室溫密封保存。

1.4.4檢測原理及結果判定 本研究采用雙抗原夾心法，檢測過程如下：將待測樣品滴加到樣品墊上，當樣品中存在布魯氏菌抗體時，會和釋放墊上QDs標記物結合，形成QDs-Ag-抗體免疫復合物，流經檢測線時，該免疫復合物和固定在檢測線上的抗原結合，發生特異性免疫反應，此時一部分量子點固定在檢測線上，形成T線。未與抗原發生反應的免疫復合物繼續向前遷移，流經質控線時被固定的二抗(SPA)捕獲，發生免疫反應，形成C線。多余的QDs標記物則會遷移，最終停留在吸收墊處。

以布魯氏菌病陽性血清為樣品,滴加70 μL到試紙條樣品墊，反應10 min后在紫外燈照射下查看結果。若C線出現紅色條帶，T線無條帶，判定為陰性；若C線和T線均出現紅色條帶，判定為陽性；若C線無條帶，不論T線有無條帶均視試紙條無效。

圖1 量子點免疫層析試紙條模型圖Fig.1 Mmodel diagram of a quantum dot immunochromatographic strip

1.5試紙條的初步性能評價試驗 將陽性血清(1∶3 200)稀釋成不同濃度滴加到樣品墊上，以PBST稀釋的BSA和正常人陰性血清作對照進行檢測，出現熒光條帶的血清最高稀釋度作為試紙條的靈敏度。同時檢測牛血清白蛋白、炭疽陽性血清、霍亂陽性血清、正常人陰性血清、布魯氏菌病陽性血清，判斷該試紙條有無非特異性。將102份布魯氏菌病陽性血清和47份健康人陰性血清分別使用試紙條和試管凝集試驗進行檢測，計算兩種方法的符合率。

2 結 果

2.1試紙條的優化 本研究從QDs用量、抗原標記使用量、抗原包被量、封閉時間、封閉劑用量等方面進行了優化。根據熒光亮度確定T線、C線的包被濃度分別為2 mg/mL、1 mg/mL，固定噴涂T線、C線的包被量分別設置為0.6 μL/cm、1 μL/cm。當QDs標記的抗原使用量為15 μL時，T線熒光最強，而在使用量分別為10 μL、20 μL時，熒光強度出現下降趨勢，分析可能是抗原過少未能與QDs完全偶聯，抗原過多抑制QDs偶聯效率。當封閉劑加入量為25 μL、封閉時間為3 h時，試紙條的熒光效果最好。最后對QDs用量進行了優化，使用25 μLQDs可使其熒光最強。后續試紙條性能評價試驗均采用上述優化參數進行檢測。

2.2重復性實驗結果 該試紙條重復性較好，紫外燈照射下陽性、陰性血清無特異性出現，并且陽性血清T線亮度沒有出現下降的趨勢。

2.3特異性試驗結果 該試紙條檢測牛血清白蛋白、炭疽陽性血清、霍亂陽性血清、正常人陰性血清T線位置均無條帶；檢測布魯氏菌病陽性血清T線位置出現條帶，證明該試紙條無特異性出現。

2.4靈敏度試驗結果 使用試紙條分別檢測原液、稀釋為2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍8種不同濃度陽性血清，在紫外燈照射下不同稀釋倍數陽性血清均出現T線(見圖2)。

(從左到右依次為原液、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍)圖2 試紙條靈敏度試驗結果圖Fig.2 Test results of strip sensitivity

2.5試紙條性能初步評價結果 經試管凝集試驗及量子點免疫層析試紙條檢測，試紙條檢測敏感性為99.0%，特異度為95.8%，兩種方法符合率為98.0%,見表1。

表1 兩種不同方法檢測病例結果Tab.1 Cases tested with different methods

量子點標記試紙條試管凝集試驗+-合計+1002102-14647合計10148149

2.6試紙條穩定性結果 用同一批次制備的試紙條分別在第5、10、15、20、25、30、35 d時檢測布魯氏菌病陽性血清，用干式免疫熒光分析儀對試紙條讀取T值，重復3次檢測并取平均值(見圖3)，其變異系數為4.1 %，表明量子點免疫層析試紙條檢測布魯氏菌病抗體重復性好，一個月的保存期內穩定性良好。

圖3 量子點試紙條穩定性試驗Fig.3 Stability test of paper strip with quantum dots

3 討 論

近年來，量子點作為一種優異的熒光標記物引起人們的重視，因其具有較寬的吸收峰，較高的熒光強度，穩定性好等特點，與傳統發光材料相比具有更優越的性能，是一種極具潛力的熒光探針制備物，在生物領域和醫學免疫方面得到飛速的發展，已廣泛應用于副溶血弧菌[8]、C反應蛋白[9]的檢測和非洲豬瘟[10]、中東呼吸綜合征[11]等傳染病的快速診斷研究。目前在生物領域使用的免疫層析試紙條多以膠體金為標記物，其普遍存在靈敏度低、易現假陽性等問題。本研究所制備的量子點免疫層析試紙條是基于免疫層析技術和抗原-抗體特異性反應建立的快速檢測布魯氏菌病抗體的方法，其過程是將金黃色葡萄球菌A蛋白與布魯氏菌全菌蛋白固定于硝酸纖維素膜，量子點與全菌蛋白偶聯物稀釋后與釋放墊冷凍干燥，構建免疫層析系統，組裝量子點免疫層析試紙條檢測布魯氏菌抗體。該法不僅結合了免疫反應與層析技術準確快速的優點，同時選擇了能與布魯氏菌抗體特異性結合的布魯氏菌抗原，相比于膠體金試紙，由于量子點基于熒光顯色，因而其抗干擾性更強，檢測限更低。同時該試紙條應用范圍廣，可針對感染布魯氏菌的人或動物進行檢測，相較于市場現有的僅用來檢測動物布魯氏菌病的膠體金試紙條，其更加具有應用價值。

本研究對試紙條制備條件進行了優化，設計制成了量子點標記免疫層析試紙條，用于檢測血清中布魯氏菌抗體，在15 min內即可實現對布病的檢測。血清用量少，當使用10 μL人或動物血清，依舊可以對其進行檢測。本實驗結果證明，量子點免疫層析試紙條是一種特異性強的檢測方法，分別滴加正常人陰性血清、胎牛血清、炭疽陽性血清、霍亂陽性血清均無非特異。朱明東等[12]使用膠體金免疫層析法檢測人血清的研究中，當血清用量為10 μL時，敏感性和特異性分別為93.6%和94.9%；另一篇關于膠體金法檢測布魯氏菌的研究中[13]，采集某市地方病防治中心布病門診的就診者血清，以布魯氏菌分離培養作為確診布病的“金標準”進行檢測。結果顯示，該課題組自制的膠體金診斷試劑盒對確診病人診斷的靈敏度為94.12%，特異度為79.41%，該試劑盒與布病診斷“金標準”比較Kappa值為0.724，符合率為86.76%。Wang[14]等以SAT法作為金標準，GICA法靈敏度和特異度分別為94.1%和81.0%。總符合率達到88.5%。在本研究中，以試管凝集試驗作為布病確診的“金標準”，使用自制的量子點免疫層析試紙條對149例臨床血清進行檢測，結果顯示其敏感度為99.0%，特異度為88.9%，兩種方法符合率為98.0%。從本次研究檢測布魯氏菌病中，敏感性、靈敏度等均較高，但是由于收集病例較少，因此后期還需要加大樣本量繼續驗證靈敏度。

隨著科學技術的發展，布魯氏菌的現場快速檢測技術已經有了很大的進展。本試驗利用量子點標記的免疫層析試紙條檢測布魯氏菌病，不論是在試驗儀器的使用，檢測時間的時長，檢測技術的應用等方面，以及對檢測布魯氏菌病敏感性與特異性上都具有顯著的優勢。該方法與試管凝集試驗相比，仍然具有操作便捷、省時省力、靈敏度髙、特異性強等優點。本研究方法制備的量子點免疫層析試紙條將布魯氏菌全菌蛋白作為標記抗原，其在目標血清檢測方面應用更加廣泛，具有便攜、高靈敏度、檢測時短、特異等優點，更適合于布魯氏菌病診斷、流行病學調查及現場應用，同時在牧區布魯氏菌病檢測、疫情控制等方面提供一種新的檢測方法。

利益沖突：無

引用本文格式：李廣強,王升啟,榮振,等.量子點標記免疫層析技術檢測布魯氏菌病的方法研究[J].中國人獸共患病學報,2019,35(5):389-392，398.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.049