多位點序列分型在新疆人間布魯氏菌病臨床分離株遺傳進化研究中的應用

李 博，岳錫宏，崔步云2，黎 唯，劉志國3，尚修建

布魯氏菌病(Brucellosis，布病)是由布魯氏菌(Brucella)屬細菌侵入機體引起的傳染-變態反應性人獸共患傳染病，該病不僅嚴重危害人類健康，且對畜牧業、旅游業、國際貿易的快速發展起到極大的負面影響[1-2]。目前，我國31個省、市、自治區都有布病人畜間流行的報道，截止2015年10月，新疆報告新發病例7 564例，第1次位居全國各省區報告新發病數的第1位，人間布病疫情防控形勢極為嚴峻[3]。

研究人間布魯氏菌分離株的種群結構和遺傳特征是深入了解布病流行機制和菌株遺傳進化關系的重要手段，可為布病流行疫區制定有效的防控措施提供科學依據。多位點序列分型(Multiple-locus sequence typing，MLST)是一種通過對研究對象的多個管家基因進行測序，經核苷酸序列逐一比對，發現差異，從而區分細菌型別的分型方法，MLST因具有良好的分辨能力，且分型結果明確，易于不同實驗室之間的比較，而被廣泛用于細菌分型和遺傳特征研究[4]。本研究為了解新疆人間布魯氏菌的種群特征和遺傳進化，選取分離自7個地州人間布病的24株布魯氏菌和布魯氏菌標準參考菌株16M(羊種)、544A(牛種)、1330S(豬種)進行MLST分型，選擇致病性強的羊種、牛種、豬種、綿陽附睪種等14種生物型代表菌株作為參考株，運用平均連鎖聚類法(UPGMA)分析分離株與參考株之間的親緣關系，同時收集過往研究的186株全國不同地區布魯氏菌分離株MLST結果，探討新疆人間布魯氏菌的種群結構和遺傳特征，掌握人間布病流行的優勢菌型。

1 材料與方法

1.1菌株信息 24株人間布魯氏菌病臨床分離株系2015、2016年分離自新疆伊犁州、烏魯木齊市、石河子市、昌吉州、博州、塔城、阿勒泰地區，且全部為羊種3型布魯氏菌。分離株由中國疾病預防控制中心傳染病所布病室分離、鑒定和保存。

1.2儀器與試劑 96孔梯度PCR儀(Sigma 德國)，水平電泳槽、電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)、凝膠成像儀(GelDoc-It310 北京天美科學儀器有限公司)；分子生物學試劑、引物合成均由北京擎科新業生物技術有限公司提供。

1.3基因組DNA提取 將試驗凍干菌株接種于布魯氏菌瓊脂斜面上進行復蘇，經純培養、抑菌實驗以及噬菌體裂解實驗鑒定后，收集菌體。采用熱滅活方式滅活細菌，然后使用北京天根生物科技有限公司基因組DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA。提取的基因組DNA于-20 ℃保存備用。

1.4引物設計 選擇布魯氏菌9個基因片段作為MLST靶標基因，靶標基因分別為：7個管家基因(gap、aroA、glk、dnaK、gyrB、trpE、cobQ)，1個外膜蛋白基因(omp25)和1個基因間區(int-hyp)。靶標基因、引物序列、基因位置和擴增長度等信息可參考文獻[5]。

1.5PCR擴增體系與程序擴增體系 Super Mix 20 μL、引物(10 μmol/L)0.5 μL、DNA 1 μL、去離子水18 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。

1.6PCR擴增產物檢測與測序 PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果與預期擴增長度一致的樣品進行純化、雙向測序并拼接。測序由北京擎科新業生物技術有限公司完成。

1.7序列分析 運用MEGA 6.0軟件對分離株的靶標基因測序結果與布魯氏菌MLST標準等位基因序列進行比對，確定分離株ST基因型。應用BioNumerics 7.5軟件進行分離株、標準株、參考株平均連鎖聚類法(UPGMA)分析，獲得各菌株間親緣進化關系。

2 結 果

2.1分離株分布特征 臨床分離株均分離自新疆布病患者，實驗室表型檢測均為羊種3型布魯氏菌。2015年分離7株，2016年分離17株；石河子市4株，烏魯木齊市2株，昌吉州8株，博州2株，塔城地區3株，阿勒泰地區1株，伊犁州4株。詳見表1。

2.2MLST等位基因及ST型比對結果 臨床分離株的9個等位基因型均相同，且序列型均為ST8型；3株布魯氏菌標準參考菌株(16M,544A,1330S)序列型分別為：ST7型，ST1型，ST14型。詳見表2。收集由中國疾病預防控制中心傳染病所布病室、烏蘭察布市地方病防治中心[6]提供的186株全國不同地區布魯氏菌分離株MLST分型結果，結果顯示ST8型是我國主要流行的布魯氏菌，在新疆、內蒙古、河北、黑龍江、寧夏、陜西、青海、山東、遼寧、四川、廣東、上海、海南等省、區均有分布，且以北方地區為主。詳見表2。

表1 分離株分布特征Tab.1 Distribution of isolatedBrucella

地區菌株數分布情況(n,年份)種型石河子地區4石河子市(3,2015),石河子總場(1,2016)B.melitensis3型烏魯木齊市2頭屯河區(2,2016)B.melitensis3型昌吉州8阜康市(1,2015;3,2016),瑪納斯縣(2,2016),呼圖壁縣(1,2016),吉木薩爾縣(1,2016)B.melitensis3型博州2博樂市(1,2016),溫泉縣(1,2016)B.melitensis3型塔城地區3額敏縣(1,2016),裕民縣(1,2016),民豐縣(1,2016)B.melitensis3型阿勒泰地區1青河縣(1,2016)B.melitensis3型伊犁州4察布查爾縣(3,2015),霍城縣(1,2016)B.melitensis3型

表2 分離株MLST分型結果Tab.2 MLST result of isolated strains

菌株MLST等位基因譜gaparoAglkdnaKgyrBtrpEcobQ omp25int-hypST型分離株(n=24)323215382816M35321521027544A21121311111330S16414352114

表3 全國不同地區布魯氏菌分離株MLST分型結果Tab.3 MLST results of isolated strains from different provinces in China

ST型等位基因譜gaparoAglkdnaKgyrBtrpEcobQ omp25int-hyp種型菌株數分布地區(n)?1211213111B.abortus 1型、2型、6型、7型10Nm(6)、Sc(2)、Sh(1)、Ah(1)2212213111B.abortus 1型、3型、9型23Nm(14)、Xj(4)、Bj(1)、Ln(1)、Gs(3)5211214111B.abortus 1型、3型5Nm(3)、Xj(1)、Bj(1)73532152102B.melitensis 1型5Qh(1)、HaiN(4)8323215382B.melitensis 1型、2型、3型99Xj(8)、Nm(18)、Nx(2)、Gd(8)、HaiN(7)、Hb(7)、HlJ(8)、Jl(3)、Ln(6)、Qh(2)、Sd(12)、Sx(15)、ShX(1)、Sh(1)、Sc(1)、17164153524B.suis 1型、3型8Gd(2)、Sc(1)、Gx(1)份、HaiN(3)、Nm(1)283103215382B.melitensis 2型、3型4Nm(2)、Hn(1)、Sc(1)29363215382B.melitensis 3型6Nm(6)303133215382B.melitensis 3型2Ln(1)、Nm(1)表3(續)ST型等位基因譜gaparoAglkdnaKgyrBtrpEcobQ omp25int-hyp種型菌株數分布地區(n)?31323815382B.melitensis 3型11Sd(7)、Xj(3)、Nm(1)33184153124B.suis 1型、3型3Gd(1)、Gx(2)34184143121B.suis 1型5Sc(1)、Nx(2)、Jl(1)、HuN(1)35184143521B.suis 1型、2型、3型5Nm(2)、Ah(1)、Bj(1)、Xz(1)

“*”：Xj：新疆、Nm：內蒙古、Sc：四川、Sh：上海、Ah：安徽、Bj：北京、Ln：遼寧、Gs：甘肅、Qh：青海、HaiN：海南、Nx：寧夏、Gd：廣東、Hb：河北、HlJ：黑龍江、Jl：吉林、Sd：山東、Sx：山西、ShX：陜西、Gx：廣西、Hn：河南、HuN：湖南、Xz：西藏

2.3新疆分離株、標準株、參考株的進化關系分析 24株臨床分離株與羊種2型、3型同屬ST8型克隆群，該克隆群與羊種ST7、ST9、ST10、ST11、ST12的親緣關系較近，而與牛種、綿羊種、豬種各ST型處于不同分枝，遺傳距離較遠；羊種、豬種、綿羊種的各ST型高度集中，并且處于同一進化分枝，表明同種不同生物型的布魯氏菌親緣關系較近，不同種布魯氏菌的親緣關系較遠；B.abortus66與其他牛種菌的遺傳距離較遠，呈現出一定的遺傳多樣性，結果見圖1。

圖1 分離株、標準株與參考株的MLST聚類分析Fig.1 Cluster analysis of isolates,standard strains and reference strains on the MLST

3 討 論

布魯氏菌6個生物種和19個生物型因其致病力不同，造成對人體致病性的差異，其中羊種布魯氏菌致病力最強，牛種、豬種菌致病力次之，這3種布魯氏菌是導致人和動物間布病傳播的重要病原體[7-8]。因此，掌握布魯氏菌分離株的生物種型即成為有效控制和治療人間布病的重要手段和前提條件。傳統表型分類方法是根據分離培養物是否需要CO2，H2S是否產生，以及染料抑菌、單相特異性血清凝集試驗和噬菌體裂解等特點進行布魯氏菌種型鑒別，但該方法耗時長、操作繁瑣、干擾因素多和生物安全風險大，造成其無法滿足突發布病公共衛生事件的應急處置需求。近年來，隨著分子生物學技術的不斷發展，AFLP、PFGE、HOOF和Rep-PCR等分型技術被廣泛用于布魯氏菌基因分型和遺傳進化研究[9-11]，但從實際應用來看，上述技術因布魯氏菌基因組高度保守、不同生物種型間的同源性較高，導致分辨率低，從而難以區分菌株之間的親緣關系。

MLST技術可直接測定多個管家基因的核苷酸序列，根據序列測定結果確定一個等位基因編號，試驗菌株的各等位基因編號按照一定順序排列，形成菌株等位基因譜，等位基因譜代表了一組核苷酸序列信息，進而能夠準確記錄菌株在基因水平上的差異。1998年，Maiden等[12]首次將該MLST技術應用到腦膜炎奈瑟菌分型，該技術以準確、分辨率高、可重復性好等優點，被廣泛地應用于其他病原微生物的分型。Whatmore等[13]運用MLST方法對布魯氏菌7個看家基因和2個非看家基因進行擴增，通過確定等位基因譜，將30個國家、地區的160株布魯氏菌分為27個ST型，且各ST型與傳統表型分型的結果基本一致。Chen YF等[14]對中國60株布魯氏菌進行MLST分型，新發現9個ST型。上述研究表明MLST技術可作為研究布魯氏菌基因分型的重要手段，通過區分菌株間的進化關系，達到追蹤溯源的目的。

本研究結果顯示24株分離株均為ST8型，與先前分離自新疆的羊種菌進化程度相同，表明新疆主要流行ST8型羊種布魯氏菌，流行菌株種型單一，菌株的管家基因、外膜蛋白基因遺傳較保守。收集、分析不同地區186株布魯氏菌MLST結果，發現我國布魯氏菌同樣以ST8型菌流行為主，且以北方地區為重點流行區域，新疆人間布魯氏菌與內蒙古、寧夏、河北、山東、青海、遼寧、陜西、四川、上海等地的分離株為同一型別，在進化樹中處于同一分支，揭示了新疆人間流行株可能是由內蒙古、寧夏、河北、山東等地引進的繁育羊所攜帶，通過人與羊密切接觸，導致了輸入性感染和流行。而本研究中各臨床分離株MLST分型高度聚集的結果卻與既往研究存在一定差異，一方面是隨著新疆畜間防控的不斷深入，染疫動物凈化、免疫接種措施的廣泛實施，促使牛種布魯氏菌流行得到較為有效的控制，由早期以牛、羊種布魯氏菌為主的流行模式逐漸轉變為以羊種布魯氏菌流行為主。另一方面是不同基因分型方法的應用造成了差異結果，且MLST方法可能存在一定的局限性，對同種不同生物型的布魯氏菌較難區分。同時，研究結果揭示了MLST分型方法雖然能夠在種的層面鑒別布魯氏菌，但卻不能有效區分各生物型，同種不同生物型可被聚為一類ST型，且局部地區的少量樣本(分離株)難以被區分，因而MLST分型方法只能作為布魯氏菌分子分型的補充手段。

本研究選取的臨床菌株分離自伊犁州、烏魯木齊市、石河子市、昌吉州、博州、塔城和阿勒泰地區，上述地區覆蓋了新疆北部全部行政區域，作為新疆主要畜牧養殖地，7個地(州、市)的人間布病發病率多年居全疆前列[15]，霍城、額敏等縣在近年存在不同程度的人間布病暴發流行，因此研究結果具有一定的代表性和參考價值，且與相關研究結果一致，均表明ST8型布魯氏菌在國內具有廣泛的分布，尤其在北方地區普遍流行[6,16-17]。羊種布魯氏菌是一種強致病性病原菌，能引起廣泛的動物間流行，并對人感染構成極大威脅[18]，根據研究結果，新疆人間布病感染源主要是染疫羊只，做好羊布病的防控是防范人間布病流行的關鍵。動物間應加強輸入羊的檢診檢疫、強化感染羊的管控，做好羊的疫苗免疫和凈化工作；人間布病防控應加強重點防控人群的宣傳教育，遵循早診斷、早治療、足量、足療程的治療原則，強化“三位一體”、醫防結合建設；檢測實驗室應推廣ELISA、實時熒光定量PCR和MLVA、全基因組測序等檢測、分型技術，以有效應對突發公共衛生事件的應急處置。

利益沖突：無

引用本文格式：李博,岳錫宏,崔步云,等.多位點序列分型在新疆人間布魯氏菌病臨床分離株遺傳進化研究中的應用[J].中國人獸共患病學報,2019,35(5):411-415，439.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.042