布魯氏菌病快速檢測(cè)試紙條的探索

孔玉方，鄭家昊2，王慧煜，梅 琳，吳紹強(qiáng)，林祥梅，韓雪清

布魯氏菌病(Brucellosis)(簡(jiǎn)稱(chēng)布病)是由布魯氏桿菌引起的以流產(chǎn)和發(fā)熱為特征的人獸共患病，嚴(yán)重威脅人和多種動(dòng)物的生命健康[1]。該病不僅對(duì)動(dòng)物的繁殖和生產(chǎn)性能具有嚴(yán)重危害，而且人在感染布魯氏菌后，難以治愈，從而造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前，全球有170多個(gè)國(guó)家和地區(qū)發(fā)現(xiàn)有人、畜布病的流行和分布[2]。此外，野生動(dòng)物也會(huì)攜帶布魯氏菌，進(jìn)而引發(fā)家畜患病，這也是老病新發(fā)的原因。因此對(duì)布病的防控成為當(dāng)前我國(guó)和全球關(guān)注的重大公共衛(wèi)生健康問(wèn)題。

目前，病原學(xué)檢測(cè)是診斷布病的金標(biāo)準(zhǔn)，而布魯氏菌的分離培養(yǎng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)人員的要求較高，需要具有經(jīng)驗(yàn)豐富的專(zhuān)業(yè)人員在BSL-3(Biosafety Level 3 Laboratory)級(jí)以上的實(shí)驗(yàn)室操作[3]?；⒓t平板凝集實(shí)驗(yàn)(rose-bengal plate agglutination test，RBT)和試管凝集實(shí)驗(yàn)(standard tube agglutination test ，SAT)具有敏感性高和特異性強(qiáng)的檢測(cè)特點(diǎn)，可用于布病的早期診斷，但不適用于現(xiàn)場(chǎng)樣品的快速篩查[4]。而基于布魯氏菌全菌作為抗原的 ELISA需在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[5]。因此，建立一種適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的方法對(duì)布病防控具有重大意義。有相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)布魯氏菌外膜蛋白(Outer membrane proteins，OMPs)是繼LPS后又一布病優(yōu)勢(shì)診斷抗原[6-7]。OMP28蛋白又稱(chēng)BP26或CP28，是一種由細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外釋放的可溶性外周漿蛋白。1996年，Lindler等[6]研究結(jié)果表明OMP28蛋白均可檢測(cè)到羊、牛、鼠感染的布魯氏菌，該蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性和免疫反應(yīng)性，可作為布魯氏菌的診斷抗原。2008年，宮曉煒等[8]發(fā)現(xiàn)BP26在人注射的疫苗中沒(méi)有缺失和弱化，采用免疫印跡檢測(cè)BP26蛋白，發(fā)現(xiàn)該蛋白敏感性高、特異性強(qiáng)。Kaushik P等[9]發(fā)現(xiàn)在OMP28誘導(dǎo)下體內(nèi)IgG含量猛增，還可以誘導(dǎo)以IgG2a介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。OMP22蛋白是由213個(gè)氨基酸組成，屬于OMP25/OMP31家族蛋白，在布魯氏桿菌的各個(gè)種屬間保守性高，這與布病的感染力有關(guān)[10]。OMP22蛋白的免疫反應(yīng)能力與布魯氏菌的脂多糖相似，均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)[11-12]。OMP22蛋白作為布病的重要毒力因子，在致病過(guò)程中OMP22蛋白主要表達(dá)分泌于細(xì)菌的表面，會(huì)引起較高的Th1免疫反應(yīng)[13]。此外，外膜蛋白OMP22可以在大腸桿菌中大量表達(dá)，降低了該蛋白作為診斷抗原的成本。

目前免疫層析技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、結(jié)果肉眼可視和無(wú)需輔助儀器檢測(cè)等特點(diǎn)，特別適合現(xiàn)場(chǎng)樣品快速初篩和基礎(chǔ)推廣。本研究將重組的布魯氏菌外膜蛋白OMP22和OMP28的混合蛋白作為膠體金標(biāo)記物，抗OMP22單克隆抗體作為質(zhì)控線(xiàn)(C線(xiàn))OMP22和OMP28混合蛋白作為檢測(cè)線(xiàn)(T線(xiàn))，組裝成檢測(cè)布魯氏菌病的免疫層析試紙條，為現(xiàn)場(chǎng)初篩提供了新的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1蛋白與血清 布魯氏菌重組蛋白OMP22、OMP28和抗OMP22單克隆抗體由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)檢所制備；布魯菌標(biāo)準(zhǔn)陰性、陽(yáng)性血清均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；牛源結(jié)核病血清、藍(lán)舌病血清、牛病毒性腹瀉血清、口蹄疫血清、牛白血病血清、小反芻獸疫血清及牛、羊、馬、豬源血清樣品，中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)檢所保存。

1.1.2主要試劑 氯金酸(HAuCl4·4H2O)、檸檬酸三鈉、高效清洗劑(Formula)、膠體金涂鍍劑(F-1307)、吸水紙(Paper-2030)、NC膜(Millipore HiFlow-95)、白色底板和金標(biāo)墊(Gls-17930)北京吉森生物科技有限公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3主要儀器 三位噴點(diǎn)系統(tǒng)(XYZ3050TM)，和切紙機(jī)系統(tǒng)(CM4000TM)美國(guó)BIO DOT公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9030A型)上海中友儀器設(shè)備有限公司；臺(tái)式冷凍超高速離心機(jī)BECKMAN COULTER；超純水系統(tǒng)美國(guó) Milipore公司。

1.2 方 法

1.2.1膠體金制備 檸檬酸三鈉還原法制備40 nm膠體金溶液：取0.01%氯金酸溶液100 mL加熱至沸騰后加入1%檸檬酸三鈉水溶液1 mL，2 min內(nèi)金黃色氯金酸溶液變?yōu)樽仙^續(xù)加熱沸騰10 min，冷卻后添加蒸餾水恢復(fù)至原體積，該方法制備的膠體金溶液采用紫外分光光度計(jì)掃描(UV-Vis)，可見(jiàn)光區(qū)最高吸收峰在(525±2)nm處為合格。

1.2.2蛋白標(biāo)記濃度的確定 采用目測(cè)法確定膠體金與待標(biāo)蛋白質(zhì)用量比例，取8個(gè)1.5 mL離心管分別加入1 mL的膠體金溶液，用0.2 mol/L K2CO3調(diào)pH 8.2，再加入用0.005 mol/L，pH值9.0的硼酸鹽緩沖液稀釋的3～15 μg /mL的OMP22和OPM28混合蛋白，5 min后在上述各管中加入0.1 mL 10% NaCl溶液，混勻后靜置2 h后肉眼觀察，保持紅色最低濃度即為蛋白最佳包被濃度，按照表1操作。

表1 蛋白最佳標(biāo)記濃度Tab.1 Optimal amount of protein

編號(hào)膠體金/mLK2CO3/μL蛋白/μgPB/μL10%NaCl/μL111001001002110397100311059510041107931005110991100611011891007110138710081101585100

1.2.3膠體金標(biāo)記過(guò)程 取5 mL膠體金溶液至15 mL離心管內(nèi)平衡至室溫，用0.1 mol/L K2CO3調(diào)pH8.2，然后根據(jù)1.2.2獲取的最適蛋白包被濃度加入相應(yīng)量的OMP22和OMP28，攪拌器攪拌20 min混勻，接著加入10% BSA 0.25 mL攪拌10 min，最后加入20%P EG20000 0.012 5 mL攪拌10 min， 10 000 r/min 4 ℃離心15 min，棄上清保留濃縮膠體金顆粒，加入1/10體積含1%BSA的PB液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4膠體金試紙條制備

1.2.4.1金標(biāo)墊預(yù)處理 將金標(biāo)墊浸泡入含有表面活性劑和金釋放液20 g/L BSA 、1 mL TrionX-100和25 g/L的PBS(pH7.4)緩沖液中，浸泡30 min后至37℃恒溫箱烘干備用。

1.2.4.2硝酸纖維素膜(NC)預(yù)處理 將NC膜在PBST溶液(含0.5% Tween20和1% BSA，pH7.4)浸泡30 min，37 ℃烘干，備用。

1.2.4.3試紙條組裝 使用三維噴金劃膜儀將1 mg/mL的OMP22、OMP28混合蛋白和抗OMP22單克隆抗體噴涂在NC膜上，分別作為T(mén)線(xiàn)和C線(xiàn)；37 ℃溫箱烘干，將樣品墊、NC 膜、金標(biāo)墊、吸水墊粘于PVC無(wú)熒光底板上，然后用BIO-DOT切割機(jī)將組裝好的條子切割成5 mm寬度的試紙條，置于卡槽內(nèi)加入干燥劑放入巴氏滴管并用密封袋封閉常溫避光保存，有效期1年，方便野外現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

1.2.5試紙條靈敏度檢測(cè) 將布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清用1×PBS緩沖液按照1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128進(jìn)行梯度稀釋。

1.2.6試紙條特異性檢測(cè) 選用同一批次試紙條對(duì)牛源布魯氏菌血清、牛結(jié)核病血清、藍(lán)舌病血清、牛病毒性腹瀉血清、口蹄疫血清、牛白血病血清及小反芻獸疫血清，觀察結(jié)果有無(wú)交叉反應(yīng)。

1.2.7實(shí)用性驗(yàn)證和ELISA試劑盒效價(jià)評(píng)定 使用同一批次試紙條對(duì)現(xiàn)場(chǎng)采集的牛、羊各100份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)以標(biāo)準(zhǔn)的ELISA試劑盒(IDEXX)和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)的虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)作為參照比，計(jì)算兩種方法檢測(cè)結(jié)果符合率。對(duì)篩出的陽(yáng)性血清按照1∶10、1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100、1∶200進(jìn)行梯度稀釋用于評(píng)價(jià)ELISA試劑盒的效價(jià)和試紙條的靈敏度。

1.2.8試紙條重復(fù)性檢測(cè) 使用同一批次和不同批次試紙條檢測(cè)布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和陰性血清，通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)試紙條的批間和批內(nèi)的重復(fù)性效果。

2 結(jié) 果

2.1膠體金溶液的鑒定 按照1.2.1方法進(jìn)行制備膠體金，結(jié)果顯示，膠體金溶液呈酒紅色，經(jīng)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描可知：膠體金橫向等離子共振吸收波長(zhǎng)在527 nm處，且峰型狹窄，說(shuō)明該膠體金顆粒均一，分散性好(圖1)。

A:40 nm粒徑膠體金溶液；B:UV-Vis 掃描光譜圖圖1 標(biāo)準(zhǔn)膠體金溶液鑒定圖譜Fig.1 Standard colloidal gold solution identification map

2.2蛋白標(biāo)記最適濃度 未加蛋白管和加入蛋白質(zhì)的量不足以穩(wěn)定膠體金溶液的各管，均呈現(xiàn)出由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象，而加入蛋白量達(dá)到或超過(guò)最低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變，膠體金溶液紅色不變的最低蛋白標(biāo)記用量為9 μg/mL(圖2)。

圖2 膠體金標(biāo)記蛋白最適濃度Fig.2 Optimization concentration determination of gold colloid binding protein

2.3試紙條靈敏度檢測(cè) 當(dāng)布魯氏標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清稀釋度達(dá)1∶128時(shí)，質(zhì)控線(xiàn)(C線(xiàn))和檢測(cè)線(xiàn)(T線(xiàn))均顯示兩條紅線(xiàn)，而稀釋度低于1∶128時(shí)，試紙條呈陰性，因此，該試紙條的靈敏度為1∶128。

2.4試紙條特異性檢測(cè) 用重組布魯氏菌外膜蛋白OMP22和OMP28的混合蛋白標(biāo)記的試紙條檢測(cè)布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、牛結(jié)核病血清、藍(lán)舌病血清、牛病毒性腹瀉血清、口蹄疫血清、牛白血病血清及小反芻獸疫血清。結(jié)果顯示，除布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)血清為陽(yáng)性外，其他均為陰性。

2.5實(shí)用性驗(yàn)證和ELISA試劑盒效價(jià)評(píng)定 用IDEXX試劑盒和國(guó)家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的RBPT分別對(duì)牛、羊各100份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，用IDEXX試劑盒檢出陽(yáng)性結(jié)果40份和陰性結(jié)果160份；使用膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)，陽(yáng)性結(jié)果38份和陰性結(jié)果162份；以RBPT檢測(cè)結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，檢出陽(yáng)性結(jié)果39份和陰性結(jié)果161份，以IDEXX試劑盒檢測(cè)結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果試紙條檢測(cè)的陽(yáng)性樣品全部來(lái)自IDEXX試劑盒檢測(cè)的40份陽(yáng)性血清樣品，即兩種檢測(cè)方法的符合率為95%(38/40)，以RBPT檢測(cè)結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果試紙條檢出的38份陽(yáng)性樣品全部來(lái)源于RBPT檢測(cè)的39份陽(yáng)性樣品，即兩種檢測(cè)方法的符合率為97.4%(38/39)。采用ELISA試劑盒檢測(cè)不同稀釋度的陽(yáng)性樣品，結(jié)果顯示陽(yáng)性血清最大稀釋度在1∶100時(shí)檢測(cè)結(jié)果為陰性，而膠體金試紙條在稀釋度為1∶100時(shí)仍可檢出，表明膠體金試紙條的靈敏度較ELISA試劑盒高。

2.6試紙條重復(fù)性檢測(cè) 使用同一批次和不同批次的試紙條檢測(cè)布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和陰性血清，試紙條的批內(nèi)和批間結(jié)果重復(fù)性良好。

3 討 論

布魯氏菌外膜蛋白具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性，在免疫診斷方面彰顯成效[14-15]。OMP28在各種屬間保守性極高，具有良好的免疫原性，Yong等[16]發(fā)現(xiàn)急性反應(yīng)期患者機(jī)體血清中OMP28蛋白抗體表現(xiàn)為陽(yáng)性，而在恢復(fù)期及慢性反應(yīng)期患者機(jī)體血清中OMP28蛋白抗體表現(xiàn)為陰性，表明該蛋白具有作為急性型感染診斷抗原的潛力。Lim等[17]用外膜蛋白OMP28免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)的IgG1和IgG2的滴度高于空白對(duì)照組20倍，并且脾臟的感染度也低，這表明OMP28可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫。2013年，有相關(guān)研究表明此蛋白可在大腸桿菌中大量表達(dá)，繼而降低了OMP28蛋白的生產(chǎn)成本，具有良好的市場(chǎng)前景和應(yīng)用價(jià)值[18]。而外膜蛋白OMP22也是一種免疫優(yōu)勢(shì)抗原，Cassataro等[19]發(fā)現(xiàn)OMP22蛋白可分布于S型布魯氏菌的表面。也有相關(guān)報(bào)道[20-21]OMP22蛋白與布魯氏菌的脂多糖成分相似，均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。Martín-Martín 等[22-23]研究發(fā)現(xiàn)缺失OMP22基因的綿羊附睪布魯氏菌在侵染HeLa細(xì)胞和J774.A1細(xì)胞時(shí)，兩種細(xì)胞的增殖分裂能力均降低，表明OMP22基因可能與布魯氏菌的毒性和感染力相關(guān)。近而表明外膜蛋白Omp28和OMP22均可作為診斷抗原應(yīng)用于布魯氏菌病快速診斷中。

鑒于布魯氏菌外膜蛋白OMP28和OMP22具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性，本研究采用雙抗原夾心法建立了一種快速、特異、敏感適用于現(xiàn)場(chǎng)和基層推廣的膠體金免疫層析試紙條。劉亞?wèn)|等[24]研制出的牛源布氏菌重組膜蛋白膠體金免疫層析試紙條具有快速、敏感、特異和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，但是檢測(cè)目標(biāo)局限于牛源血清樣品，本研究在劉亞?wèn)|等研究者的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，采用膠體金標(biāo)記OMP28和OMP22混合蛋白，將OMP28、OMP22混合蛋白和抗OMP22的單克隆抗體分別作為T(mén)線(xiàn)和C線(xiàn)噴涂于NC膜上，可以用于檢測(cè)牛、羊等動(dòng)物的血清。本研究將OMP28和OMP22結(jié)合既可增強(qiáng)抗原的免疫原性、免疫反應(yīng)性，也可防止漏檢。結(jié)果表明該方法制備的試紙條具有良好的特異性和敏感性，不與牛源結(jié)核病血清、藍(lán)舌病血清、牛病毒性腹瀉血清、口蹄疫血清、牛白血病血清和小反芻獸疫血清發(fā)生交叉反應(yīng)；牛、羊源血清樣品檢測(cè)結(jié)果與商品化ELISA試劑盒符合率為95%；檢測(cè)布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清靈敏度達(dá)1∶128。RBPT作為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法從200份樣品中篩選出39份陽(yáng)性樣品，膠體金試紙條檢測(cè)38份陽(yáng)性樣品全部來(lái)自39份陽(yáng)性樣品，兩種檢測(cè)方法的符合率為97.4%。說(shuō)明膠體金試紙條檢測(cè)的靈敏度高，但偶爾也會(huì)有假陽(yáng)性的結(jié)果，可能與下列因素有關(guān)：①T線(xiàn)距離結(jié)合墊較近；②過(guò)量的金標(biāo)粒子噴涂結(jié)合墊；③選用NC膜型號(hào)的層析速度過(guò)慢。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中我們需要針對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行改進(jìn)。此外，采用雙抗原夾心法制備的試紙條有時(shí)質(zhì)控線(xiàn)和檢測(cè)線(xiàn)結(jié)果會(huì)偏弱，這是由于金標(biāo)墊抗原會(huì)和檢測(cè)線(xiàn)上包被的抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合樣品中的抗原表位，后續(xù)我們可以通過(guò)金標(biāo)ProteinA，質(zhì)控線(xiàn)包被單抗IgG，以此提高檢測(cè)信號(hào)和試紙條的靈敏度。

本研究以牛源布魯氏菌外膜蛋白OMP22和OMP28作為金標(biāo)抗原，制備了快速檢測(cè)布魯氏菌病的膠體金免疫層析試紙條，相信通過(guò)對(duì)上述不足條件進(jìn)一步優(yōu)化后，可以滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)大批量樣品的初步篩查。

本研究獲得了粒徑均一，分散良好的膠體金溶液和蛋白標(biāo)記的最適濃度，并且本研究制備的膠體金試紙條在檢測(cè)血清抗體方面具有良好的敏感性、特異性及重復(fù)性。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：孔玉方,鄭家昊,王慧煜,等.布魯氏菌病快速檢測(cè)試紙條的探索[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2019,35(5):460-464. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.053