噬菌體展示布魯氏菌蛋白文庫構建及差減篩選融合蛋白

布魯氏菌病(簡稱布病)是由布魯氏菌引起的一種人獸共患病，感染動物表現睪丸炎、不孕、不育、流產等癥狀，人類感染為波浪熱、關節炎、脾臟腫大，也可引起生殖系統障礙[1-2]。布病嚴重影響動物生產性能和產品品質，對畜牧業的生產和健康發展帶來重大損失。近年來在我國北方部分地區、特別是牧區出現上升趨勢，嚴重影響畜牧業發展和農牧民身體健康[3-4]。該病治療效果較差，以預防為主。故建立快速、準確診斷方法是控制、凈化布病的必要手段。

目前布病的檢測方法主要有病原學檢測、血清學檢測及分子生物學檢測。現以血清學方法最為成熟，常用的方法有平板凝集(RBT)、試管凝集(SAT)、補體結合實驗(CFT) 、ELISA等。其中RBT由于操作簡單，但敏感性、特異性均不高，而廣泛地被用作現場的大規模初篩性試驗；SAT雖然能用于定性檢測，但主要檢測血清中的IgM, 由于IgM在血清中存在時間較短、含量也不如IgG高等原因，導致該方法敏感性、特異性也不高；CFT也能用于定性檢測，但由于操作繁瑣、耗時長也不常被采用。ELISA由于其快速、操作簡單，在國際貿易中被世界動物衛生組織(OIE)規定為檢測布病的指定方法，被公認為是一種比較有前途的方法。但是血清學方法檢測的是菌體表面的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，布魯氏菌的LPS與傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、小腸耶爾森菌O∶9等存在相似結構，故在診斷中存在假陽性[5]。因此，新型診斷抗原的研制是建立ELISA方法的關鍵。

布魯氏菌表面蛋白具有較強的免疫原性，而且在布魯氏菌各個種間具有高度的保守性，以表面蛋白作為診斷抗原不容易和其他細菌，如大腸桿菌、小腸耶爾森菌等發生交叉反應，減少假陽性[5-7]。很多表面蛋白，如omp25、 omp28、omp31和bp26都曾被用做診斷抗原研究，但究竟哪個/些表面蛋白的特異性強、敏感性高，目前仍在探索。

由于噬菌體展示技術可以構建大容量文庫并具有高通量篩選等特性，本研究利用噬菌體展示技術構建布魯氏菌蛋白文庫，通過差減篩選，選擇具有良好特異性、親和力及反應原性的表面蛋白，為確定診斷用抗原奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料 TG1大腸桿菌(廣州碧云天生物有限公司)；羊型布魯氏菌16M株(標準熱滅活,本室保存)；輔助噬菌體VCSM13(海軍總醫院周麗君教授惠贈)；噬菌粒載體pYW01(梅西大學Jasna教授惠贈)。 VCSM13及pYW01經測序鑒定，序列全部正確。

Taq Master Mix、細菌基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒、DNA Marker(康為世紀公司)；T4 DNA ligase、末端快速補平試劑盒、SmaI內切酶、蝦堿性磷酸化酶(NEB公司)；超聲波細胞粉碎儀(新芝SCIENTZ-IID型)；電轉儀(BIO RAD公司)。噬菌粒載體pYW01引物由長春庫美生物科技有限公司合成，上游引物5′- AACATATGAAATACCTGCTGCCGAC-3′，下游引物5′- TCTTCCTCAGAGATCAGCTTCTGCT-3′。

1.2 噬菌體展示布魯氏菌16M株基因組文庫構建

1.2.1布魯氏菌16M株基因組提取及基因組片段化 以布魯氏菌16M株菌液(經熱滅活)為模板，利用細菌基因組提取試劑盒提取16M株基因組，具體操作按試劑盒進行。

將超聲條件設定為輸出功率40%,每次超聲3 s,間隔6 s,超聲次數為10下，超聲DNA總體積約500 μL，將基因組DNA隨機打斷。利用膠回收試劑盒對線性片段回收，以除去小于200 bp大于3 000 bp的片段。

1.2.2破碎基因組片段末端補平 將細菌基因組超聲片段進行隨機片段末端平齊化，體系如下：DNA隨機片段38 μL、T4 DNA polymerase 1 μL、10×T4 DNA polymerase reaction buffer 5 μL、dNTP Mixture 2 μL、H2O 4 μL，11 ℃反應20 min,70 ℃滅活10 min。補平后利用膠回收試劑盒對其進行純化，準備連接。

1.2.3酶切質粒pYW01及去磷酸化SmaⅠ單酶切噬菌粒載體pYW01，體系如下：10× buffer 5 μL、SmaI 1 μL、pYW01 30 μL，Water 14 μL。25 ℃，反應5 h。然后利用蝦堿性磷酸酶(rSAP)直接進行去磷酸化，以防止載體自連，即直接在酶切反應結束后的體系中加入rSAP 1.5 μL，37 ℃溫育60 min后65 ℃熱滅活20 min。去磷酸化后膠回收試劑盒進行純化，準備連接。

1.2.4感受態細胞制備 取1 mL TG1母液接種到200 mL新鮮的LB培養液中,37 ℃,170 r/min 振蕩培養2.5 h，使OD450達到0.7左右。冰浴30 min，4 000 r/min，4 ℃離心20 min，棄上清收集菌體。用含有10%甘油的無菌水洗滌菌體2次。最后用400 μL 10%甘油無菌水重懸細胞沉淀,分裝，每管100 μL，-80 ℃保存備用。

1.2.5連接 利用T4 DNA ligase將末端補平的布魯氏菌16M株基因組超聲片段和酶切質粒pYW01(去磷酸化)以4∶1比例(摩爾比)進行連接，體系如下：DNA隨機片段12 μL、pYW01 1 μL、T4 DNA ligase 1 μL、10×ligation buffer 2 μL、H2O 4 μL。22 ℃連接1 h 后70 ℃熱滅活5 min。

1.2.6電轉化 將連接產物20 μL電轉化至100 μL 感受態細胞中。(冰浴條件下，將連接產物和感受態細胞用槍頭緩慢混合均勻)電轉化條件為：1 mm電擊槽、電壓1 800 V、電阻200 Ω、電容25C，同時將2 μL 噬菌粒載體pYW01轉入100 μL TG1中作為對照，以檢測感受態轉化效率。電轉完成后立即加入900 μL LB液體培養基,震蕩活化45 min(37 ℃，170 r/min)，此即為噬菌體展示布魯氏菌16M株基因文庫。

1.3基因文庫容量計算及隨機性檢測 取上述10 μL連接菌液用LB液體培養基稀釋至100 μL，均勻涂布于LB固體培養基(20 μg/mL氯霉素)37 ℃過夜培養。觀察各平板菌落形成數量，以公式計算庫容量(cfu/mL)=菌落數×稀釋倍數×10。

隨機挑取菌落，LB液體培養基(20 μg/mL氯霉素)搖動約6 h，取菌液行PCR，鑒定文庫插入效率。 PCR體系如下：上、下游引物各0.5 μL，Taq Master Mix 5 μL，菌液1 μL，用水補足體積至10 μL。 Touch-down PCR運行程序：94 ℃ 1 min, 94 ℃ 30 s, 65 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s, 72 ℃ 10 min。 其中退火溫度從65 ℃依次降落到50 ℃，溫度每降落一度運行兩個循環，最后50 ℃運行10個循環，共計40個循環,1%瓊脂糖電泳檢測結果。

1.4 噬菌體展示布魯氏菌16M株蛋白文庫構建

1.4.1輔助噬菌體滴度檢測 10 μL輔助噬菌體VCSM13 用LB液體培養基10倍稀釋，稀釋成10-1～10-1010個稀釋度。分別取100 μL(10-6、10-8、10-10)稀釋輔助噬菌體和新鮮培養的宿主菌(TG1)100 μL混合均勻后，加入5 mL軟瓊脂混勻后快速倒入已預熱的LB固體培養基中(20 μg/mL氯霉素)，37 ℃倒置培養12～16 h。具體操作按照文獻進行[8]，噬菌體滴度(pfu/ mL)=斑數×稀釋倍數×10。

1.4.3純化噬菌體蛋白文庫 上述培養物，室溫4 000 r/min 離心10 min；棄上清，用100 mL LB培養基重懸沉淀，加入卡那霉素使其終濃度達到50 μg/mL，37 ℃培養過夜；次日將菌液 4 000 r/min 離心 20 min，將上清轉移至無菌離心管內，分別加入1/4 體積的PEG8000- NaCl溶液，劇烈搖晃后，4 ℃過夜放置，沉淀噬菌體；4 ℃，10 000 r/min 離心 30 min；棄上清，用 3 mL PBS 重懸沉淀，即為輔助噬菌體包裝后的展示蛋白文庫，0.22 μm濾膜過濾除菌即得到純凈的噬菌體懸液。

1.4.4測序鑒定蛋白文庫 利用質粒小提試劑盒提取此懸液質粒DNA，電轉化至TG1感受態細胞，條件同1.6.2。將轉化菌液涂布于含氯霉素的LB平板上，37 ℃過夜培養，隨機挑取20個單克隆送公司測序。將測序序列與GenBank中16M株序列比對，鑒定蛋白文庫。

1.5 差減淘選

1.5.1差減篩選 將噬菌體展示文庫作為流動相,將M5免疫羊血清作為固定相。將免疫血清包被在孔內，加入噬菌體展示蛋白文庫，二者進行吸附。以未被吸附的噬菌體展示文庫作為流動相，陽性血清作為固定相。提前將陽性血清包被在孔內，加入免疫血清未吸附的噬菌體展示蛋白文庫，進行淘選。對差減淘選的噬菌體文庫進行2輪富集。

1.5.2擴增陽性克隆，測序 ① 對淘選到的陽性克隆進行擴增:挑取每個單克隆轉接至新鮮2×YT液體培養基中，37 ℃振蕩培養過夜。再轉接TG1菌液中，培養至OD=0.4左右后，加入輔助噬菌體VCSM13d3(MOI=1∶100)超感染，以擴增單個陽性克隆噬菌體文庫。② 用質粒小量抽提試劑盒提取重組質粒，操作方法按說明書進行。③ 對陽性重組質粒進行Touch-down PCR鑒定，分析插入片段大小；對鑒定陽性的質粒送公司測序。

1.6噬菌體陽性克隆篩選 競爭ELISA、Western-blot評價陽性克隆的親和力、特異性及反應原性，篩選具有良好抗原性的噬菌體陽性克隆。① 提取LPS，按試劑盒操作進行；② 競爭ELISA評價陽性克隆的親和力：以篩選到的噬菌體融合蛋白包被，以提取16M株LPS作為競爭相，檢測陽性克隆的親和力；并利用prism軟件分析陽性克隆親和力；③ Western-blot評價陽性克隆的特異性及反應原性，DS-PAGE檢測：取純化后的噬菌體融合蛋白進行SDS-PAGE電泳，同時以輔助噬菌體VCSM13作為陰性對照。轉膜：剪下和凝膠大小吻合的6 張3M濾紙和1張PVDF膜(戴手套操作)，PVDF膜先在甲醇溶液中浸泡15 s，轉入去離子水中漂洗后，連同3M濾紙轉入半干轉印緩沖液中，浸泡30 min。將膠用去離子水沖洗后，也放在半干緩沖液中平衡。然后將膠、膜、濾紙制成三明治，注意每一層都不能有氣泡，否則影響轉印效果。疊好后，根據膜的大小，來確定轉印時電流的大小(具體條件的設定參考儀器說明書)。本試驗采用200 mA電流下轉印60 min。

免疫檢測：轉印完成后將膜用麗春紅染色，看膠上的目的條帶是否轉到膜上；然后用蒸餾水漂洗膜，用10%馬血清封閉1 h后，用PBS洗滌3次，每次5 min；然后用新鮮配置的一抗(陽性血清)室溫封閉膜70 min，再用PBST漂洗3次，每次5 min；用新鮮配置的二抗(兔抗羊血清)封閉膜35 min，洗膜3次，操作同上，然后再用PBS洗滌1次，3 min；用DAB染色3～5 min至膜上的條帶清晰后，用蒸餾水終止反應。

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2 結 果

2.1羊型布魯氏菌16M株基因組提取及超聲破碎結果 羊型布魯氏菌16M株(標準熱滅活)基因組提取結果見圖1。從圖中可見DNA提取濃度較高；經OD260/280分析，基因組純度也達到要求。取DNA約500 μL進行超聲裂解，結果見圖1。瓊脂糖凝膠電泳顯示，基因組裂解后隨機片段大小集中分布在0.3～2 kb之間。

1：Marker從上到下大小依次為100 bp，250 bp，500 bp，750 bp，1 000 bp，1 500 bp，2 000 bp，3 000 bp，5 000 bp，10 000 bp；2：馬爾他布魯氏菌16M株DNA提取結果；3： Marker；4：基因組DNA超聲裂解結果圖1 布魯氏菌基因組及超聲破碎電泳檢測結果Fig.1 Result of DNA extraction and cleavage

2.2酶切噬菌粒載體pYW01結果 提取載體質粒pYW01，經1%瓊脂糖凝膠電泳顯示條帶大小與預期質粒大小相符(圖2)。質粒經測序(長春庫美生物有限公司)表明，提取結果正確。經SmaI單酶切后，在目的位置發現單一條帶(圖2)。 對其進行去磷酸化后，準備連接。

2.3構建羊型布魯氏菌16M株全基因組文庫 取100 μL轉化后菌液涂板，經37 ℃過夜培養后，有菌落在含氯霉素的LB平板上長出，證明重組噬菌粒載體pYW01成功電轉至TG1感受態細胞。菌落大小、形態一致。經計算庫容量約為108pfu/ mL，達到建庫要求。

隨機挑取17個單菌落，利用Touch-down RCR程序鑒定插入文庫的片段，結果見圖3。結果表明，插入片段具有較好隨機性，且插入片段大小分布在0.2～3.0 kb間。

1：Marker從上到下大小依次為100 bp，250 bp，500 bp，750 bp，1 000 bp，1 500 bp，2 000 bp，3 000 bp，5 000 bp，10 000 bp；2：提取噬菌粒pYW01；3：SmaI單酶切噬菌粒pYW01圖2 提取質粒pYW01及SmaI單酶切結果Fig.2 Result of plasmid extraction and SmaI enzyme digestion

1：Marker從上到下大小依次為100 bp，250 bp，500 bp，750 bp，1 000 bp，1 500 bp，2 000 bp，3 000 bp，5 000 bp，10 000 bp；2～18：PCR鑒定結果圖3 1%瓊脂糖電泳檢測全基因文庫中插入片段結果Fig.3 Insert fragments of the library

2.4構建羊型布魯氏菌16M株蛋白文庫 基因文庫經輔助噬菌體VCSM13感染后，即可包裝成蛋白文庫。經PEG純化后，對原始蛋白文庫電轉化增殖，37 ℃過夜培養，即為增殖的蛋白文庫。隨機挑取LB平板上20個單克隆送公司測序。將測序結果與16M株序列比對，基因同源性達到98%以上。結果表明，成功構建羊型布魯氏菌16M株表面蛋白文庫。

2.5差減淘選，擴增陽性克隆，測序 利用免疫血清及感染血清對噬菌體展示蛋白文庫進行差減淘選、兩輪富集后，得到37個陽性克隆。每輪富集結果見表1。

表1 每輪淘選后陽性克隆數Tab.1 Number of positive clones each round of panning

第一輪(pfu/mL)第二輪(pfu/mL)富集率噬菌體投入量2.0×1072.0×107-洗脫物滴度1.0×1043.0×105300×

對陽性克隆進行擴增，提取質粒進行Touch-down PCR鑒定，分析插入片段大小；對鑒定陽性的質粒送公司測序。經Blast，篩選出6個噬菌體融合蛋白，結果見表2。

表2 陽性噬菌體融合蛋白Tab.2 Positive phage fusion protein

ACCESSIONlocus_tagproductAE008917BMEI1242hypothetical membrane spanning proteinCP007763DK63_1291hypothetical proteinCP007763DK63_1023outer membrane autotransporter barrel domain proteinCP007763DK63_628glutamate racemaseCP007763DK63_1659outer membrane autotransporter barrel domain proteinAE008918BMEII0036outer membrane protein oprf(an outer membrane porin)

2.6競爭ELISA評價陽性克隆的親和力 以篩選到的噬菌體融合蛋白包被，以提取16M株LPS作為競爭相，檢測陽性克隆的親和力，以輔助噬菌體VCSM13d3作為對照，結果表明，以融合蛋白BMEI1242、DK63-1291、BMEII0036親和力最強見圖4。且經統計學分析，3個融合蛋白之間差異沒有統計學意義(F=0.038 22,P>0.05)。

2.7Western-blot評價陽性克隆的特異性及反應原性 以布魯氏菌病陽性血清為一抗，進行Western-blot分析各個陽性克隆的特異性及反應原性，以VCSM13d3為陰性對照，結果見圖5。結果表明，這6個噬菌體融合蛋白均具有較好的反應原性及特異性，而與輔助噬菌體不發生發應。

圖4 噬菌體融合蛋白c-ELISA結果Fig.4 Result of c-ELISA of phage-fusion proteins

1：低分子量蛋白Marker; 2：BMEII0036; 3：DK63_1659; 4：DK63_628; 5：DK_631023; 6：DK63_129; 7：VCSM13d3; 8：BMEI124圖5 感染/陽性血清的 Western-Blot 結果Fig.5 Result of Western-Blot

3 討 論

布魯氏菌病新型診斷抗原的研究主要集中在兩個方面。LPS作為傳統的診斷抗原，一直不斷被試圖改造[9-12]。LPS含有M和A兩個表位，其中A表位是引起交叉反應的主要原因，而這兩個表位還不能被分離[13]。因此新合成的LPS只含有M 表位或者含有被改造的A表位。但化學方法合成的LPS在生物學活性上，可能會大大降低。本研究通過利用噬菌粒載體pYW01及輔助噬菌體VCSM13構建了噬菌體展示布魯氏菌表面蛋白文庫，使目的蛋白能與噬菌體的pⅢ蛋白融合，共同展示在噬菌體表面。后續利用靶分子即可對文庫進行高通量篩選，并且該技術還可以將基因型與表型聯系起來。因此，噬菌體展示技術在腫瘤標記物的識別、新型抗毒血清治療、疫苗候選株篩選、藥物開發、蛋白質組學研究等方面得到廣泛應用[14-17]。本研究所用噬菌體展示系統，是Jasna教授等人于2013年構建，該系統能降低外源蛋白對于宿主菌(大腸桿菌)的毒性，提高展示效率等特性[18]。此系統用于構建布魯氏菌表面蛋白文庫還是首次，為布魯氏菌新型診斷抗原的篩選奠定基礎。

致謝本研究得到梅西大學Jasna Rakonjac教授，海軍總醫院周麗君教授的無私幫助。

利益沖突：無

引用本文格式：王闊鵬，于凌嬌，劉倩宏,等.噬菌體展示布魯氏菌蛋白文庫構建及差減篩選融合蛋白[J]. 中國人獸共患病學報,2019,35(5):376-381.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.056