微生物標準菌株不同保藏方法的比較

林嘉欣，安 東，劉 瑩，孫雪蓮，孫小紅

（大連出入境檢驗檢疫局技術中心莊河分中心，遼寧大連 116400）

標準菌株是實驗室不可缺少的一部分，一般由美國模式培養物集存庫、中國工業微生物菌種保藏管理中心等菌株保藏機構提供，其遺傳特性得到了確認、保證和可追溯性。實驗室常將標準菌株應用于檢測方法比較、培養基技術驗收、檢測陽性對照、人員技術比對、儀器設備性能的監控[1]等，是微生物檢測質量控制的重要手段之一[2]。而菌株保藏是一切微生物工作的基礎，其目的是使菌株被保藏后減少死亡、變異、被雜菌污染，并保持其良好的活性[3]。因此，實驗室在選擇標準菌株的保藏方法時至關重要。至今，現有的菌株保藏方法幾十種，筆者只選擇其中3種方法進行比較，從操作、保藏時間、占用空間和菌株存活情況4個方面進行分析，從而比較出3種保藏方法中保藏效果最優的方法。

1 菌株保藏的原理

為了能夠長期保持標準菌株的良好活性，如何降低因微生物旺盛生長、繁殖而引起的標準菌株變異率就成為核心問題，因此必須創造一種良好的環境，能夠降低微生物的新陳代謝，使微生物生長繁殖遲緩。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 菌株來源

實驗室標準菌株來源，美國模式培養物集存庫、中國工業微生物菌種保藏管理中心。

2.1.2 試劑、培養基及器材

半固體瓊脂、無菌液體石蠟，均購于青島高科園海博生物技術有限公司提供；新鮮牛奶；菌株保藏管。

2.2 方法

2.2.1 半固體瓊脂石蠟保存法

配制好半固體瓊脂培養基，分裝試管，于121℃下高壓滅菌15 min，垂直放置凝固后備用。

用接種針挑取復活后的標準菌株菌落垂直穿刺于半固體瓊脂培養基中，接種針距離試管底部1/3處即可，多次穿刺。接種完的半固體瓊脂菌株管放于培養箱培養后，在無菌的環境下，取適量滅菌的液體石蠟滴加于半固體瓊脂菌株管表面，放于4℃冰箱中保藏，一年需要進行轉種鑒定1次。

2.2.2 細菌濕種牛奶凍存法

將新鮮牛奶煮沸，冷卻后脫去上層脂肪層，分裝小試管，每管1 mL，滅菌后備用。將標準菌株劃線接種于平板，分離培養后，用接種環刮取2～3環菌落接種于牛奶中充分混勻，放于-20℃冰箱中保存。使用時，取出菌株管放于室溫下溶解，待部分溶解時即可取出1環劃線接種于平板，并將菌株管再迅速凍存，每個菌株管可反復使用3～5次[4]。此法一般菌株可存活5年左右。

2.2.3 菌株保藏管法

菌株保藏管法是通過利用成品化的菌株保藏管對需要保藏的菌株進行保藏，它是一種用于菌株保藏或轉移的容器[5]。挑取復活后的菌株制成菌懸液，接種到菌株保藏管中混勻，使菌株吸附在每個磁珠上，然后用無菌吸管將保藏管中多余的液體吸出，在保藏管壁上標記菌株的信息及接種時間，將菌株保藏管置于-70℃的超低溫冰箱中保藏，可保存10年。菌株復蘇時，只要取出菌株保藏管，不要解凍，用接種針或鑷子取出磁珠劃線接種于固體培養基或直接置于液體培養基中培養。菌株保藏管使用后要盡快放回超低溫冰箱中保藏。

3 結果與分析

不同種標準菌株保藏方法存在的利弊不同，因此對每種保藏方法從操作、保藏時間、占用空間和菌株存活情況進行具體分析和比較。

3.1 半固體瓊脂石蠟保存法

（1）該方法前期準備工作比較繁瑣，需要進行培養基的配制，而且菌株保藏過程中需要定期加入無菌液體石蠟。

（2） 該方法每年需要轉種1次，而《中國藥典》（2015年版）明確規定“菌株的傳代次數不得超過5代（從菌株保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0代）”[6]，因此該方法保藏菌株時間較短。

（3）需要垂直保藏，占用空間較大。

（4）菌株不易發生污染、變異等問題。

3.2 細菌濕種牛奶凍存法

（1）該方法前期準備工作相對繁瑣。

（2）保藏時間較長。

（3）試管體積偏大，占用菌株保藏空間較大。

（4）使用時需要室溫溶解，可能會出現培養基變質等問題，并且反復使用容易造成菌株污染、變異、活性降低等。

3.3 菌株保藏管法

（1）該方法操作簡單，減少了菌株保藏的前期準備工作。

（2）菌株保藏時間長，減少了定期轉種的麻煩。

（3）保藏管體積較小，能夠節省保藏空間。

（4）該方法不會發生因培養基變質而使菌株發生變異、污染、活性降低等問題。

對3種不同標準菌株保藏方法進行比較。3種不同保藏方法的比較見表1。

表1 3種不同保藏方法的比較

4 結論

闡述了3種不同的菌株保藏方法，從操作、保藏時間、占用空間和菌株存活情況4個方面進行比較：從操作方面看，半固體瓊脂石蠟保存法和細菌濕種牛奶凍存法的前期準備工作相對繁瑣，而菌株保藏管法減少了這方面的麻煩，從而減少了人力的輸出；從保藏時間方面，半固體瓊脂石蠟保存法保藏時間短，需要定期轉種，菌株管理比較麻煩，而細菌濕種牛奶凍存法和菌株保藏管法保藏時間較長；從占用空間方面，半固體瓊脂石蠟保存法和細菌濕種牛奶凍存法都是用試管來保藏菌株，占用很大空間，菌株保藏管體積小，節省保藏空間；從菌株存活情況方面，細菌濕種牛奶凍存法可能因轉種過程中培養基變質導致菌株發生變異、污染、活性降低等問題。綜上可以看出，菌株保藏管法要優于另外2種方法。