板芪口服液的工藝研究

董蒨蒨,孫耀貴,孫 娜,尹 偉,范闊海,李宏全

(山西農業大學動物科技學院,山西 太谷 030801)

板芪口服液的處方是本實驗室前期篩選出來用于治療豬病毒性心肌炎的復方中藥。為了能更簡便、有效的使用此方劑治療疾病,本實驗室依據此處方將其研制為口服液。口服液的研制過程包括提取、純化和成型工藝。其中提取工藝影響著中藥制劑的質量、藥用資源及臨床療效,關系到中藥制藥產業的發展。不良的提取工藝造成中藥制劑提取周期長、有效成分損失多、提取物中雜質量高等問題[1],影響中藥的推廣。純化工藝與口服液的澄清度有關,澄清度是口服液的重要質控指標,它反映了產品穩定性,是口服液制備中的關鍵問題[2]。因此,必須在傳統中醫藥基礎上進一步優化中藥制劑工藝使其更符合現代化生產并且建立科學可行的質量控制體系,這對中獸藥制劑的研發甚至中獸藥事業的發展具有極其重要的意義[3]。本實驗圍繞板芪口服液工藝的提取、純化、防腐等環節進行優化,旨在建立更有效、更穩定的工藝,為板芪口服液申報新獸藥提供數據支持。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(Agilent公司)；自動煎藥包裝機(中國吉首市中誠制藥機械廠)；旋蒸儀(Buchi公司)；數顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠)；電子分析天平(賽多利斯公司)；SB25-12D超聲清洗機(Scientz公司)。

1.2 試藥 黃芩苷對照品(批號110715-201720)。原料藥材板藍根、黃芩、黃芪、丹參、連翹、蒲公英由山西奧信動物藥業有限公司提供。甲醇為色譜純(Merck公司),水為超純水,其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 吸水率的考察 按組方稱取板藍根10 g、黃芪10 g、黃芩5 g、丹參5 g、連翹5 g、蒲公英5 g藥材3組,加入10倍量水,封口,室溫放置,分別于0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h 取出1 份藥材,濾除水,稱重,計算吸水率。如表1在1.5 h后吸水量明顯減少,故在煎煮之前需加10倍量水浸泡1.5 h。

表1 板芪口服液藥材吸水率

2.2 黃芩苷的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SBC18(250 mm ×4.6 mm,5 μm),流動相：甲醇：水：磷酸(47∶53∶0.2),流速：1 mL/min,檢測波長：280 nm,柱溫：25 ℃,進樣量：10 μL,以黃芩苷計理論塔板數不低于2 500[4]。

2.2.2 樣品溶液的制備 對照品制備：精密稱定黃芩苷對照品12.25 mg,加甲醇稀釋制成61.25 μg/mL的對照品溶液。供試品制備：精密量取板芪口服液5 mL于100 mL容量瓶中,加入70%乙醇定容至刻度,搖勻,濾過,取續濾液1 mL加甲醇至10 mL,即得供試液。

2.2.3 線性范圍考察 精密吸取黃芩苷對照品溶液(3.828 mg/mL)1 mL,2 mL、3 mL、4 mL、6 mL、8 mL置于25 mL容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,按照2.2.1項的條件進行進樣,記錄峰面積,以進樣量為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,計算得回歸方程y=3 021.3x-31.634,R2=0.999 9,結果表明,黃芩苷進樣量在0.153 1～1.225 μL之間線性關系良好。

2.3 板芪口服液水提工藝的考察 根據表2進行L9(34)正交試驗。每次按照處方稱取藥材40 g,按表添加相應倍量水,回流提取,過濾,提取液濃縮至40 mL,根據2.2項的方法計算黃芩苷的含量,結果如表3與表4。表3極差分析結果表明,各因素對水提液中黃芩苷提取影響的大小順序為C(提取次數)＞A(加水量)＞B(提取時間)。表4方差分析結果表明,因素C對黃芩苷提取結果有極顯著的影響,因素A、B各水平間無顯著性差異,但考慮到生產周期與成本,最終確定板芪口服液的最佳提取條件為A2B2C2,即加10倍量水浸泡1.5 h后,煎煮2次,每次1.5 h。并根據最佳工藝進行3次驗證試驗,得到黃芩苷的平均含量為5.59 mg/mL,相對標準偏差(Relativestandarddeviation,RSD)為0.62%,小于1%。

表2 板芪口服液水提工藝正交表

表3 板芪口服液水提工藝參數確定正交試驗結果

表4 方差分析表

2.4 板芪口服液醇沉工藝的考察 按照以上工藝制備板芪口服液的水提樣品,根據表5進行L9(34)正交試驗,得到結果表6與表7。表6極差結果表明,各因素對水提液中黃芩苷提取影響的大小順序為B(醇沉濃度)＞A(生藥濃度)＞C(靜置時間)。方差分析結果表明,因素A與B對黃芩苷提取結果有極顯著的影響,故選擇A1B1。因素C無顯著性差異,但是,乙醇加入量隨著提取液濃度升高而減少,綜合考慮黃芩苷損失率和乙醇用量最終確定板芪口服液的最佳醇沉條件為A2B1C1,即藥液濃縮至1.5 g/mL,加入乙醇至含醇量為60%,4℃放置12 h。根據最佳工藝進行3次驗證實驗,得到黃芩苷的平均含量為3.38 mg/mL,RSD為0.87%,小于1%。

表5 板芪口服液醇沉實驗正交表

表6 板芪口服液醇沉工藝參數確定正交試驗

表7 方差分析表

2.5 板芪口服液的水沉工藝 由于揮發乙醇后的樣品加入蒸餾水有明顯的沉淀產生,所以考察不同靜置時間24 h、48 h、72 h對樣品澄清度的影響。結果得到3種靜置時間的樣品澄清度相似,48 h后沉淀不再增多,所以選擇靜置時間為48 h。最終確定板芪口服液的水沉工藝為回收乙醇后加水至生藥濃度為1 g/mL,4℃靜置48 h,過濾。

2.6 板芪口服液的防腐工藝 取經以上工藝制得的板芪口服液樣品加入3‰苯甲酸鈉,進行需氧菌、真菌、酵母菌、大腸桿菌的微生物限度檢查試驗,各種數目均符合獸藥典中的規定。所以確定防腐劑為3‰苯甲酸鈉。

2.7 三批樣品的驗證實驗 按照板芪口服液的處方稱取3份藥材,根據所確定的最佳提取、醇沉、水沉和防腐工藝進行制備,得到3批樣品,其中黃芩苷的平均含量為2.05 mg/mL,RSD為1.76%。

3 討論

本試驗中的板芪口服液是主要由板藍根、黃芪、黃芩等組成的中藥復方制劑。黃芩苷是黃芩藥材的主要活性成分,具有抗炎的作用,主治諸熱、惡瘡[5],并且黃芩苷的含量高,提取過程中誤差小,具有統計學意義。所以將黃芩苷作為板芪口服液工藝檢測的指標成分。

板芪口服液在提取工藝之前進行了吸水率的測定,主要目的是為了讓有效成分更完全的溶解到溶劑中,1.5 h后藥材吸水率變化逐漸減小,因為口服液的制備周期不宜過長,所以選擇了在提取前浸泡藥材1.5 h。根據預試驗和實驗室前期經驗設計了提取工藝中正交試驗的3種因素：加水量、提取時間和提取次數,并分別設計了3個水平。其中提取時間過長或過短都不利于口服液的質量,所以3個水平設計的時間分別為1 h、1.5 h、2 h。

板芪口服液醇沉工藝中生藥濃度濃縮至2g/mL以上時不但很難再濃縮并且無法精確測量其體積,所以設計的生藥濃度分別為1g/mL、1.5 g/mL、2 g/mL。醇沉濃度在預試驗過程中,嘗試從10%到90%乙醇濃度進行醇沉,濃度過低時不產生沉淀,濃度低于60%時沉淀較少,濃度過高時考慮到實際生產中的乙醇的耗費,最終選擇60%、70%、80%乙醇濃度。對靜置時間的設定考慮到口服液工藝的生產周期,所以不宜過長,選擇了12 h、24 h、36 h這3個靜置時間。

板芪口服液的水沉工藝采取了冷藏水沉法[6],考察到不同靜置時間對口服液澄清程度的影響與工藝的生產周期,選擇了48 h的靜置時間。板芪口服液的防腐工藝是依據獸藥生產經驗與相關文獻選擇了3‰ 苯甲酸鈉[7]作為防腐劑。最終確定板芪口服液的工藝為一份藥材加10倍量水浸泡1.5 h后煎煮2次,每次1.5 h,藥液濃縮至1.5 g/mL,加入乙醇至含醇量為60%,4℃靜置12 h,回收乙醇,加水至生藥濃度為1 g/mL,4℃靜置48 h,過濾,加入3‰的苯甲酸鈉。

本試驗從口服液提取、醇沉、水沉、防腐工藝環節出發,優化了板芪口服液工藝,為板芪口服液申報新獸藥奠定了數據基礎。