布魯菌抗體ELISA檢測方法比較試驗

曹 蕓,封 林,曾 政,黃 誠,黃 恒,姚 璐

(1.重慶市動物疫病預防控制中心,重慶 渝北 401120；2.重慶市綦江區動物衛生監督所,重慶 綦江 401420)

布魯菌病(簡稱“布病”)是一種嚴重威脅人類健康的世界性人獸共患病,本病對動物主要危害是流產和不孕,但人感染布魯菌后,往往難以治愈。世界動物衛生組織(OIE)將其收錄入多種動物共患病名錄中,我國將其列為二類動物疫病[1]。據統計,全世界每年因布病造成的經濟損失近30億美元[1]。對于動物布病防控,我國主要采取檢疫淘汰與免疫相結合的策略[1]。

布病檢測的常規方法包括細菌學和血清學方法。細菌分離鑒定是布病流行、疫情判定及臨床診斷最直接的手段,然而,該方法存在生物安全隱患,且耗時長,在大規模臨床檢疫檢測中不適用[2]。血清學檢測仍是當前診斷動物布病的主要方法,包括虎紅平板凝集試驗(RBT)、補體結合試驗(CFT)和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等[3]。目前《國家布魯菌病防治計劃(2016-2020年)》中規定的布魯菌抗體血清學確診方法有試管凝集試驗(SAT)、補體結合試驗(CFT)、間接酶聯免疫吸附試驗(iELISA)和競爭酶聯免疫吸附試驗(cELISA)[4]。當臨床開展大規模的血清學檢測時,試管凝集試驗不僅操作復雜、耗時長,而且存在特異性不高的問題,目前OIE已不推薦使用該方法[5]；補體結合試驗雖是公認的確診方法,但試驗操作復雜,需有良好的試驗設施和訓練有素的人員作準確的組分滴定、試劑保存和結果判斷[3-5],故在檢測中并不常用；ELISA方法具有通量大、操作簡便、結果易于判定等優點而被廣泛用于日常檢疫檢測。

為了客觀評價布魯菌抗體診斷試劑,提供臨床布病檢測參數,本研究選取3家不同單位的ELISA試劑盒對田間采集的經CFT檢驗的180份血清樣本(牛、羊血清各90份)分別進行檢測,比較不同ELISA試劑盒之間以及試劑盒與CFT之間的符合率,確定診斷試劑盒的檢測效果。

1 材料與方法

1.1 血清樣本 共計180份(其中牛、羊血清各90份),由本實驗室從田間采集、保存。

1.2 主要試劑 牛/羊布魯菌間接ELISA抗體檢測試劑盒(iELISA-IVDC),批號2017011；布魯菌競爭ELISA抗體檢測試劑盒(cELISA-IVDC),批號2017011；購自中國獸醫藥品監察所。cELISA抗體檢測試劑盒(cELISA-Sva),購自Svanova公司,貨號10-2701-02；iELISA抗體檢測試劑盒,分別購自Svanova公司(iELISA-Sva)和IDEXX公司(iELISA-idexx),貨號分別為104890和BAT1132T；補體結合試驗所用的補體、溶血素、抗原、對照陰性和陽性血清,全部購自國家獸醫微生物菌種保藏中心。

1.3 補體結合試驗所用紅細胞 按參考文獻[3]制備。

1.4 方法

1.4.1 符合率試驗 將180份血清樣本分別采用iELISA-IVDC、 cELISA-IVDC、 iELISA-Idexx、 iELISA-Sva和cELISA-Sva進行檢測,并用國際貿易指定的補體結合試驗(CFT)進行最終定性檢測,確定試劑盒與CFT間的符合率,以及不同試劑盒之間的符合率。

1.4.2 補體結合試驗 具體按動物布病診斷技術國家標準(GB/T 18646—2002)[6]及《中華人民共和國獸用生物制品規程》(2000版)“布魯菌病補體結合試驗抗原與陰、陽性血清制造及檢驗規程”中提及的方法進行[7]。

2 結果

2.1 不同試劑盒與CFT之間符合率,其結果見表1～表5。

表1 iELISA-IVDC試劑盒與CFT的符合率

表1結果顯示,以CFT檢測結果為最終判定標準,IVDC研制的iELISA-IVDC試劑盒與CFT的結果符合率為98.9%。

表2 cELISA-IVDC試劑盒與CFT的符合率

表2結果顯示,以CFT檢測結果為最終判定標準,IVDC研制的cELISA-IVDC試劑盒與CFT的結果符合率為96.7%。

表3 iELISA-Sva試劑盒與CFT的符合率

表3結果顯示,以CFT檢測結果為最終判定標準,SVANOVA研制的iELISA-Sva試劑盒與CFT的結果符合率為93.3%。

表4 cELISA-Sva試劑盒與CFT的符合率

表4結果顯示,以CFT檢測結果為最終判定標準,SVANOVA研制的cELISA-Sva試劑盒與CFT的結果符合率為89.4%。

表5 iELISA-Idexx試劑盒與CFT的符合率

表5結果顯示,以CFT檢測結果為最終判定標準,IDEXX研制的iELISA-Sva試劑盒與CFT的結果符合率為87.8%。

2.2 不同來源試劑盒間符合率,結果見表6和表7。

表6 IVDC試劑盒間的符合率比較

表6結果表明,IVDC研制的cELISA-IVDC與iELISA-IVDC抗體檢測試劑盒的符合率為98.3%。

表7 SVANOVA試劑盒間的符合率比較

表7結果表明,SVANOVA研制的的cELISA-Sva試劑盒與iELISA-Sva試劑盒的符合率為91.7%。

3 討論與結論

3.1 比較試驗中采用了180份田間樣品,其中經CFT檢測為陽性的樣本約占總數的2/3。選擇3個不同生產單位的布魯菌抗體檢測診斷試劑盒對所有樣品進行檢測,發現不同單位生產的布病診斷試劑盒檢測結果之間存在一定的差異。鑒于CFT是國際布病血清學檢測公認的確診方法,因此本試驗所用樣本均以CFT檢測結果為最終判定標準。通過比對試驗,iELISA-IVDC和cELISA-IVDC與CFT的符合率最高；對同一單位的產品,iELISA-IVDC與cELISA-IVDC之間的符合率也高于其他生產單位的布病試劑盒。對于同一單位的不同產品檢測結果存在差異,分析其原因主要與iELISA與cELISA兩者反應原理不同有關,iELISA僅僅檢測了血清中的IgG類抗體,而cELISA同時檢測了IgG和IgM兩種類型的抗體,理論上cELISA檢測的敏感性要高于iELISA。

3.2 對于布魯菌抗體ELISA檢測試劑盒,近年來獲批的國產試劑盒主要以中國獸醫藥品監察所研發為主[8-10],而在我國市場銷售的進口布魯菌抗體ELISA試劑盒,包括瑞典Svanova公司的iELISA試劑盒、cELISA試劑盒以及美國IDEXX公司的iELISA試劑盒。從臨床實踐來看,進口的cELISA試劑盒中的單克隆抗體、iELISA試劑盒中的酶標二抗均為凍干保存,用時復溶,剩余的復溶后的單克隆抗體需-20℃保存,且保存時間有限制；國產的cELISA-IVDC/iELISA-IVDC檢測試劑盒中的所有試劑均在2℃ ～8℃保存,操作簡便,且不涉及抗體凍融,能更穩定且更有利于試劑盒板條的多次拆分使用。另外,進口試劑盒樣本和二抗作用時間均為1 h,國產試劑盒樣本和二抗作用時間均為30 min,試驗用時較短。比較發現IVDC的布病試劑盒在操作時間上具有明顯優勢,且檢測結果的符合率略高于同類進口制品,說明國產IVDC布病ELISA診斷試劑盒具有較好的應用前景。