秦皇島地區(qū)貂源大腸桿菌(E.coli)的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)分析

肖麗榮,周 琦,李巧玲,張艷英,張召興,2,賈青輝,史秋梅

(1.河北科技師范學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 秦皇島 066604；2.河北旅游職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系,河北 承德 067000)

水貂大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起水貂一種常見的腸道傳染病,該菌可以感染各個(gè)年齡段的水貂,尤其是40～60日齡的幼貂最易感,臨床上主要表現(xiàn)急性敗血型、腹瀉、痙攣、神經(jīng)癥狀等,發(fā)病率和死亡率均較高,給水貂養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。大腸桿菌(E.coli)是一種存在環(huán)境中條件致病菌,血清型復(fù)雜,該菌引起多種動(dòng)物及人發(fā)病,造成嚴(yán)重的局部或全身性感染[2]。2012年史秋梅等[3]報(bào)道了引起水貂嚴(yán)重腹瀉的E.coli血清型為O78、O38、O29具有很強(qiáng)的致病性。E.coli引起不同日齡水貂腹瀉、腸炎,甚至呈急性死亡[4]。E.coli易產(chǎn)生耐藥性,由于在養(yǎng)殖水貂的過程中大量不合理使用抗菌藥物,導(dǎo)致E.coli耐藥菌株不斷出現(xiàn),許多敏感藥物變?yōu)槟退?其耐藥譜不斷增大,導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)大量的抗菌藥物殘留,從而形成藥物惡性循環(huán)[5]。本試驗(yàn)對(duì)秦皇島地區(qū)不同養(yǎng)殖場(chǎng)腹瀉水貂的腸內(nèi)容物及糞便,利用細(xì)菌常規(guī)的方法,分離鑒定出42株致病性E.coli,進(jìn)行藥敏試驗(yàn)分析,結(jié)果表明,該地區(qū)水貂E.coli的具有很強(qiáng)耐藥性,為該地區(qū)水貂源E.coli防控提供依據(jù)。

1 材料

1.1 病料來源 秦皇島地區(qū)不同水貂養(yǎng)殖場(chǎng)采集腹瀉水貂的腸內(nèi)容物及糞便等進(jìn)行分離培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 藥敏紙片、微量發(fā)酵管由北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)；伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基 、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基由青島高科園海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；ID32E腸道菌鑒定試劑條由法國(guó)梅里埃公司生產(chǎn)；常規(guī)儀器與試劑均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 體重22 g左右健康昆明系小鼠180只,購自于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 細(xì)菌分離純化 采集腹瀉水貂的腸內(nèi)容物及糞便處理后劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基37℃恒溫培養(yǎng)12～24 h,挑取優(yōu)勢(shì)菌落接種于伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),并在在普通瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)。

2.2 細(xì)菌形態(tài)特征 無菌挑取通過伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基及普通瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)后菌落,經(jīng)革蘭染色鏡檢。

2.3 細(xì)菌生化特性鑒定 利用ID32E腸道菌鑒定試劑條及微量發(fā)酵管,按說明書進(jìn)行操作,用ATB全自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生化試驗(yàn)鑒定。

2.4 致病性試驗(yàn) 試驗(yàn)組每株菌攻毒4只小鼠,劑量按0.2 mL/只,腹腔注射(5×108CFU/mL),對(duì)照組4只小鼠注射等量的營(yíng)養(yǎng)肉湯。觀察發(fā)病及死亡情況,剖檢小鼠對(duì)其肝、肺等組織進(jìn)行分離鑒定。

2.5 藥敏試驗(yàn) 按照K-B紙片法進(jìn)行試驗(yàn)操作和結(jié)果判斷[6]。取分離純化的分離菌接種營(yíng)養(yǎng)肉湯,37℃震蕩培養(yǎng)12 h～15 h,使菌液濃度調(diào)整至0.5號(hào)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)管濁度,涂抹于瓊脂平板,貼上藥敏片,置37℃培養(yǎng)16 h～18 h,測(cè)定抑菌圈直徑。美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的標(biāo)準(zhǔn)

3 結(jié)果分析

3.1 細(xì)菌分離純化與形態(tài)觀察 分離菌在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)出呈粉紅色、邊緣光滑整齊、濕潤(rùn)的扁圓的菌落；伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上長(zhǎng)出深紫黑色、帶金屬光澤的圓形菌落。在普通瓊脂平板上長(zhǎng)出白色、光滑濕潤(rùn)的菌落。革蘭染色鏡檢,分離菌為革蘭陰性菌,兩端鈍圓,短小桿狀菌。

3.2 生化試驗(yàn)結(jié)果 該42株分離菌株吲哚試驗(yàn)為陽性、V-P試驗(yàn)為陰性,均能產(chǎn)酸不產(chǎn)氣,不分解尿素,發(fā)酵甘露醇、葡萄糖、海藻糖、麥芽糖、阿拉伯糖、鼠李糖等。用ATB全自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)分析,鑒定結(jié)果為均E.coli,評(píng)定結(jié)果合格率為99.3%。

3.3 致病性試驗(yàn) 試驗(yàn)組小鼠24～48 h左右發(fā)病死亡,進(jìn)行剖檢和細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定。結(jié)果顯示,從死亡的小鼠體內(nèi)分離的菌與該菌一致。對(duì)照組4只小鼠健康存活,表明該分離菌株有一定致病性。

3.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果與多重耐藥分析 由表1藥敏試驗(yàn)結(jié)果可見,34株水貂源致病性E.coli對(duì)頭孢克肟、氟苯尼考、阿米考星等高度敏感；對(duì)新霉素、氨芐西林、紅霉素等中度敏感；其中復(fù)方新諾明、阿莫西林、四環(huán)素、耐藥率最高達(dá)100%,磺胺間甲氧異惡唑耐藥率87.7%,其他藥物耐藥率為40.4%～75.0%之間

根據(jù)藥敏結(jié)果,由表1和表2可以看出,該地區(qū)的水貂源致病性E.coli呈多重耐藥。其中耐13種藥物的菌株數(shù)最多達(dá)12株,耐15種藥物的細(xì)菌有2株,耐14種藥物的細(xì)菌有3株,耐12種藥物的有7株,耐10種藥物的有5株,耐9種藥物的有2株,耐8種藥物的有3株。

4 討論

秦皇島地區(qū)不同養(yǎng)殖場(chǎng)腹瀉水貂的腸內(nèi)容物及糞便中分離鑒定出42株致病性E.coli,從形態(tài)學(xué)觀察、培養(yǎng)特性分析、生化鑒定等方面特性與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》報(bào)道一致。通過人工感染試驗(yàn)小鼠,試驗(yàn)組小鼠發(fā)病死亡,對(duì)照組4只小鼠健康存活,從死亡的小鼠體內(nèi)分離的菌與該菌一致。證實(shí)該菌有一定致病性。E.coli是引起不同日齡水貂腹瀉的主要病原菌。相關(guān)報(bào)道了2011-2013年間山東10個(gè)不同水貂養(yǎng)殖場(chǎng)E.coli感染率為14.04%[7]。潘德芹等[8]報(bào)道山東地區(qū)241份水貂病料中檢出致病性E.coli占11.2%。該菌對(duì)我國(guó)水貂養(yǎng)殖造成很大的危害。

本試驗(yàn)對(duì)其秦皇島地區(qū)分離的34株水貂源致病性E.coli對(duì)常用的18種抗菌藥物進(jìn)行了藥敏試驗(yàn),分析其耐藥性。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,34株致病性E.coli僅頭孢克肟、氟苯尼考、阿米考星等4種藥物高度敏感；對(duì)阿莫西林、四環(huán)素等4種藥物耐藥率達(dá)100%,該地區(qū)的水貂感染的E.coli具有很強(qiáng)的耐藥性。與于杰等[9]報(bào)道的水貂源E.coli對(duì)氟喹諾酮類藥物產(chǎn)生強(qiáng)的耐藥性基本上一致。史秋梅等[3]報(bào)道了對(duì)腹瀉水貂進(jìn)行了藥敏分析,對(duì)恩諾沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素敏感,與本試驗(yàn)藥敏結(jié)果存在一定的差異性,可能與該菌攜帶的耐藥基因有關(guān)。通過藥敏試驗(yàn)分析表明,該地區(qū)的水貂源致病性E-.coli呈多重耐藥性,且耐藥菌在8種藥物以上。孫蓉蓉等[10]報(bào)道,青島地區(qū)10株貂源E.coli對(duì)18種抗生素不同程度的耐藥,對(duì)氨芐西林、鏈霉素等耐藥性大于50%,并且呈現(xiàn)多重耐藥,其中2個(gè)菌株同時(shí)耐9種藥,2個(gè)菌株同時(shí)耐4種藥等。地域不同,其該菌的耐藥性存在一定的差異,根據(jù)該菌易流行及易產(chǎn)生耐藥特點(diǎn),對(duì)其該菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn),分析其該菌耐藥性,合理使用抗生素,降低該菌耐藥性,才能起到良好的防治效果。

表1 34株貉源大腸桿菌對(duì)18種抗生素的耐藥結(jié)果 (n=34)

表2 34株貉源E.coli的多重耐藥分析