中藥對鮑曼不動桿菌的體外抑菌試驗

李永慧,王洪彬,朱利霞,吳同壘,孔慶山,張志強

(1.秦皇島第二醫院,河北 昌黎 066600；2.河北科技師范學院動物科技學院河北省預防獸醫學重點實驗室,河北 秦皇島 066004)

隨著中國經濟的快速發展、人民消費水平的提高,水產魚類消費品的需求量大幅度提高,水產養殖業朝著集約化、規模化的方向發展。近年來,水產養殖中細菌病頻發,且病死率極高,給水產養殖造成了重大的經濟損失,極大限制了海水養殖業的發展[1]。相關研究表明,鮑曼不動桿菌在鱖魚養殖中暴發病害,死亡率高達90%,給廣大養殖戶帶來巨大經濟損失等[2]；同時該菌也是人類的條件性致病菌,主要引起呼吸道感染、手術部位感染以及泌尿系統感染等[3],引起了廣大科研人員和養殖工作者的關注。

在中國,中藥用于水產動物養殖相比抗生素和化學療法防控細菌病來說,具有低毒、無抗藥性以及提高魚類水產養殖動物攝食率和抗病能力等優點[4],深受養殖工作者的信賴。試驗通過選取蘇木、黃連等多味中藥水煎液對鮑曼不動桿菌進行了體外抑菌試驗,進一步篩選出對該病原菌具有明顯抑菌作用的中藥,為進一步水產用藥提供重要的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 試驗菌株從患病死亡的舌鰨魚肝臟分離得到,經實驗室工作人員前期鑒定,最終確定為鮑曼不動桿菌,并保存于河北科技師范學院、河北省預防獸醫學重點實驗室-80℃低溫冰箱中。

1.1.2 中藥和試劑 中藥：女貞子、蘇木、板藍根、連翹、黃芩、夏枯草、苦參、馬齒莧、桔梗、防風、郁金香、蒲公英、厚樸、香附、青皮、荊芥、烏梅、紫花地丁、石榴皮、訶子、艾葉、知母、龍膽草、梔子。試劑：營養肉湯培養基,購自青島高科園海博生物技術有限公司；普通的營養瓊脂,購自北京陸橋技術股份有限公司。

1.1.3 主要儀器 G1040WS-立式自動壓力蒸汽滅菌器,致微(廈門)儀器有限公司；無菌工作臺,北京亞泰科隆儀器技術有限公司；冰箱,青島海爾特種電冰箱有限公司；隔水式恒溫培養箱,上海一恒科學儀器有限公司,其他與試驗相關的儀器均由河北科技師范學院、河北省預防獸醫學重點實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 試驗菌液制備 用無菌接種環挑取甘油凍存的鮑曼不動桿菌臨床分離株,接種到4 mL營養瓊脂培養基中,置于28℃隔水式恒溫培養箱中培養12～16 h。從營養瓊脂平板上挑取單菌落,接種于含有3 mL的營養肉湯培養基中培養16～24 h。用滅菌水稀釋培養液,使菌液濃度達到1×107CFU/mL,備用。

1.2.2 單味中藥藥液制備 采用水煎煮法制備試驗所需要的中藥藥液。將中藥藥材用水洗干凈,烘干；用電子天平準確稱取中藥藥材100 g,置于1 000 mL的燒杯中,加入500 mL蒸餾水,浸泡2 h；武火加熱至沸騰,改用文火加熱40 min,4層紗布過濾,藥渣加入適量的蒸餾水,采用同樣的方法煎熬,過濾,棄去藥渣,合并兩次過濾所得的藥液,過濾,加熱濃縮至終體積100 mL,即中藥藥液終濃度為1 g/mL[5]。

1.2.3 中藥體外抑菌圈直徑的測定 利用牛津杯法測定中藥對鮑曼不動桿菌的抑菌圈大小。在營養瓊脂平板上加入100 μL的試驗菌液(菌液濃度為1×107CFU/mL)菌液,用無菌涂布器將菌液涂布均勻；在培養基表面等距離的擺放4個牛津杯并輕輕按壓,使其培養基接觸；在杯中加入不同的單味中藥藥液各200 μL,每種藥物做3個重復；置于28℃隔水式恒溫培養箱中培養16～24 h,觀察結果[6]。

結果判定：以牛津杯周圍無肉眼可見細菌生長區為抑菌圈,用直尺測量抑菌圈直徑大小,取3次測量結果的平均值作為藥物對鮑曼不動桿菌的抑菌圈大小。抑菌圈直徑以d表示,當d＜10 mm時,為耐藥(R)；當10≤d≤15時,為中度敏感(I)；當d＞15 mm時,為高度敏感(S)。

1.2.4 最小抑菌濃度(MIC)的測定 采用肉湯二倍稀釋法測定中藥對鮑曼不動桿菌的最小抑菌濃度。將單味中藥藥液(藥液濃度為1 g/mL)依次用營養肉湯進行二倍稀釋總共稀釋11個梯度；依次加入到96孔細菌版的11個孔中,每孔加入200 μL,然后每孔加入20 μL菌液(菌液濃度為1×107CFU/mL)；第12孔中加入200 μL的營養肉湯,加入20 μL菌液(菌液濃度1×107CFU/mL)做空白對照；置于28℃隔水式恒溫培養箱中培養16～20 h,觀察結果[7-8]。為方便觀察試驗結果,可在96孔細菌培養板中加入濃度為5 g/L的TTC(氯化三苯四氮唑,加入該物質目的是準確判斷MIC值)5 μL,并28℃置于隔水式恒溫培養箱中培養2 h。判定標準：當孔內不顯示紅色時,為該中藥對鮑曼不動桿菌的MIC。

1.2.5 MBC值的測定 在加入TTC顯示顏色變紅的各個孔中,分別吸取50 μL接種于營養瓊脂平板上,培養12～16 h,觀察結果。平板上無細菌生長時所對應孔最小的藥物濃度即為該中藥對鮑曼不動桿菌的MBC。

2 結果

2.1 中藥對鮑曼不動桿菌的藥敏試驗結果 采用牛津杯法檢測鮑曼不動桿菌對常用中藥的藥物敏感性,結果見表1。鮑曼不動桿菌對蘇木、連翹、夏枯草、烏梅、紫花地丁這5種中藥高度敏感；尤其是蘇木對該菌的抑制效果最好,抑菌圈高達28 mm；對黃芩和青皮中度敏感；對訶子、女貞子、板藍根、苦參、馬齒莧、桔梗、防風、郁金香、蒲公英、厚樸、香附、荊芥、石榴皮、艾葉、知母、龍膽草、梔子耐藥。說明中藥對鮑曼不動桿菌具有一定程度的敏感性。

表1 中草藥對鮑曼不動桿菌的體外抑菌試驗

2.2 中藥對鮑曼不動桿菌的MIC和MBC 采用營養肉湯二倍稀釋法檢測中藥對鮑曼不動桿菌的MIC和MBC,結果見表2。蘇木對鮑曼不動桿菌的MIC=MBC=31.3 mg/mL,相比其他中藥的MIC和MCB小；其次為夏枯草,MIC=MBC=62.5 mg/mL,連翹和黃芩對該菌的MIC相同,均為125.0 mg/mL,但前者MBC為125 mg/mL,后者MBC為250 mg/mL；青皮和紫花地丁對該菌的MIC和MBC均為250 mg/mL；烏梅對該菌的MIC=250 mg/mL,MBC=500 mg/mL。說明每種藥物對桿菌的敏感度不同,水產養殖可以此為參考合理安排用藥量,用于鮑曼不動桿菌病的防控。

表2 中藥對鮑曼不動桿菌的MIC和MBC (mg/mL)

3 討論

近年來,隨著水產養殖規模的擴大和養殖數量的增多,細菌性疾病,如弧菌病、愛德華菌病、假單胞菌病以及鮑曼不動桿菌病等頻發,給水產養殖健康、長遠發展帶來了極大的挑戰,因此對水產養殖致病菌的準確檢測和防控尤為重要[9]。尤其是鮑曼不動桿菌是一種人獸魚共患菌,引起了廣大科研工作者和養殖工作者的極大關注。鮑曼不動桿菌是不動桿菌屬成員之一,革蘭染色陰性菌,不發酵糖,有莢膜、菌毛且無鞭毛和芽孢[10]。相關的文獻顯示,鮑曼不動桿菌極易產生耐藥性,常常導致水產養殖用藥的失敗,且能用于有效防控該致病菌的藥物又少[11]；此外對常用抗生素的耐藥率有逐年增加的趨勢,這引起了相關研究人員的極大關注[3]。

中藥具有來源廣泛、價格低廉、毒性較低、不易產生耐藥性等優點,在防病抗病毒的同時還能增強機體的免疫力,提高動物機體整體的抗病抗菌能力[6]。因此中藥作為抗生素的替代藥物在解決藥物殘留和抗藥性方面具有良好的發展前景。從試驗結果可以看出,蘇木、連翹、夏枯草、烏梅、紫花地丁這5種中藥對鮑曼不動桿菌高度敏感；蘇木對該菌的MIC和MBC相等,均為31.3 mg/mL；夏枯草對該菌的MIC和MCB均為62.5 mg/mL；連翹和黃芩對該菌的MIC均為125.0 mg/mL,但前者MBC為125 mg/mL,后者MBC為250 mg/mL；青皮和紫花地丁對該菌的MIC和MBC均為250 mg/mL；烏梅對該菌的 MIC=250 mg/mL,MBC=500 mg/mL,其他中藥對該菌表現耐藥,說明部分中草藥對鮑曼不動桿菌具有一定程度的抑制作用。