芪藍四君子湯對雛雞小腸IL-2和IFN-γ mRNA表達的影響

張殿新,吳 垠,宋臣鋒,田啟超,劉 冬,馬奎紅,鐘秀會

(1.滄州職業技術學院畜牧獸醫系,河北 滄州 061001；2.滄州市工貿學校經貿教學管理部,河北 滄州 061001；3.河北農業大學動物科技學院,河北 保定 071001)

近年來,許多學者應用醫學、動物醫學、免疫學及現代生物化學等領域里的新技術、新方法,進行了中藥免疫增強劑的研究,并取得了一些研究成果[1-2]。其中現代分子免疫學研究認為,基因的轉錄產物mRNA是基因與表達產物間的橋梁,基因活化的直接結果是mRNA轉錄增加,而且蛋白的合成有賴于mRNA的翻譯,因此特異性mRNA水平的變化可以較生物活性測定更準確地反應基因的活化狀態[3]。大量研究表明,許多中藥能夠誘導并調節免疫細胞產生細胞因子,從而發揮強大的免疫調節和免疫激活作用[4-5]。因此,研究中藥對細胞因子的基因表達對于闡明分子水平的免疫調節機制、以及免疫應答發生的機理等都是至關重要的,檢測中藥對細胞因子的誘生活性已成為評價中藥對機體免疫調節作用的重要指標之一。

中藥方劑四君子湯出自宋代太醫局編著的《太平惠民和劑局方》,由人參 、白術 、茯苓、炙甘草四味中藥組成,是中醫扶正固本的經典名方,具有益氣健脾之功效。近年來隨著對四君子湯研究的深入,人們開始廣泛關注其對機體的免疫調節功能 。筆者的前期試驗證實,芪藍四君子湯(四君子湯基礎上增加黃芪和板藍根)能增強雛雞體液免疫及局部黏膜的免疫功能[6-7],本試驗在前期的基礎上采用半定量RT-PCR方法,測定了芪藍四君子湯對雛雞空腸中IL-2和IFN-γ mRNA豐度的影響,旨在從分子水平探討芪藍四君子湯的黏膜免疫增強作用和機制,為研制新型畜禽用免疫增強劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 中藥方劑及藥液制備 芪藍四君子湯是在四君子湯的基礎上進行加減而得,由黨參(易人參)、黃芪、板藍根、茯苓、白術、炙甘草六味中藥組成,比例為3∶2∶2∶2∶2∶1,上述中藥均購自北京同仁堂保定藥店。按組方比例稱取中藥,放入容器內加水煎煮25 min～30 min,過濾取汁。然后再加水煎煮1次,將兩次藥液混合濃縮,使每毫升含生藥1 g,高壓滅菌后于4℃冰箱中保存備用[8]。臨用時根據所需濃度進行稀釋。

1.2 試驗動物處理及樣品采集 90只1日齡健康雛雞(京白939雛雞,購自滄州曹莊子雞場)；隨機分為5組,每組18只,常規飼養管理。14日齡進行首次免疫,Ⅰ ～Ⅳ組每只雞經口腔免疫2羽份(106EID50/羽)雞新城疫 LaSota系凍干苗[瑞普(保定)生物藥業有限公司,批號：080519]0.5 mL,35日齡時重復免疫。Ⅰ～Ⅲ組,于免疫前2 d分別按0.125 g/mL、0.25 g/mL、0.5 g/mL 3 個濃度灌服芪藍四君子湯1 mL,連續10 d。Ⅳ組和Ⅴ組灌服等量生理鹽水。見表1。

表1 試驗分組與用藥

各組分別于20、40、60日齡,隨機選取6只雞剖殺,分別無菌采取相同部位腸管(空腸),用錫箔紙包好編號后放入液氮中速凍備用,在采集過程中做好防RNA酶污染的必要措施。

1.3 主要試劑 總RNA提取試劑盒(離心柱型DP419),dNTP、RNA酶抑制劑(RNasin)、反轉錄酶(M-MLV)、DNA 聚合酶(Taq)、DL-2 000 DNA Marker、Oligo(dT)18為保定天根生物試劑公司產品。

1.4 雞IL-2、IFN-γ、β-actin基因引物設計與合成

參考GenBank上已發表序列,設計了用于同時擴增雞的 IL-2(AF017645)、IFN-γ(NM_205149)、β-actin(L08165)基因的2對引物。并由寶生物工程(大連)有限公司合成,引物序列具體如下：

IL-2 上 游： 5′-TATCGAAAAGAACCTCAAG-3′；下 游： 5′-CCAGAATGGACAGCAGA-3′(245 bp)；IFN-γ 上游：5′-GCTGACGGTGGACCTATT-3′；下游：5′-CAAGTCGTTCATCGGGAG-3′(240 bp)； β-actin上游：5′-CATCTATCGTGGGTCGC-3′；下游：5′-CTCCTTGATGTCACGCAC-3′(547 bp)。

1.5 半定量RT-PCR方法的建立 所有進行RNA分離純化的試管,槍頭和電泳槽等均用DEPC處理過的水浸泡24 h以上,配置試劑時使用DEPC處理過的水。嚴格按照DP419試劑盒說明書提取總RNA,并計算RNA濃度,RT合成cDNA第一鏈。

1.5.1 IL-2、β-actin同管擴增指數期循環數和同管擴增引物比例的確定 用多個平行管,在同一PCR管中同時加入IL-2和β-actin引物,使IL-2、β-actin基因同管擴增,PCR循環參數為94℃5 min,94℃45 s,56℃45 s,72℃1 min,在不同循環圈數時取出一管放在4℃暫時保存,待所有的循環結束后再一起72℃延伸10 min,將產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,電泳結束于凝膠成像分析條帶的凈灰度。

將IL-2引物和β-actin引物進行適當稀釋,將β-actin擴增限制在一定范圍,但相對量不變,使擴增后的電泳條帶凈灰度與目的基因條帶凈灰度之比大約為1∶1。然后各取引物按照確定的循環數進行PCR,產物行1%瓊脂糖凝膠電泳,并分析條帶的凈灰度。

1.5.2 IFN-γ、β-actin同管擴增指數期循環數及擴增引物比例的確定 IFN-γ、β-actin同管擴增指數期循環數及擴增引物比例的確定方法同上。

1.6 試驗樣本的檢測與灰度分析 試驗樣本的總RNA提取和RT-PCR測定按照1.5建立的半定量RT-PCR方法(循環數,引物比)進行檢測,每樣本擴增3管。取PCR產物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳。用TotalLab V2.01軟件進行灰度分析和圖像處理。按下式計算基因的mRNA表達的相對含量：IL-2或IFN-γ基因相對表達值=IL-2或IFN-γ基因條帶灰度值/β-actin基因條帶灰度值,作為 IL-2或 IFN-γ基因表達水平的指標。

1.7 數據統計 所有數據,采用SPSS13.0統計軟件對各項數據進行One Way ANOVA分析。以P＜0.01(差異極顯著),P＜0.05(差異顯著)作為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 IL-2、β-actin同管擴增循環數摸索結果 電泳結果如圖1所示,當PCR進行到25個循環時二者都出現了條帶,β-actin清晰,IL-2仍然很弱。但到34個循環時擴增開始出現非特異條帶。所以,為了保證試驗樣本在指數期內測定,選擇31個循環為本試驗檢測IL-2時PCR擴增的循環數。

圖1 IL-2、β-actin同管擴增循環數摸索結果的電泳圖

2.2 IL-2、β-actin基因同管擴增引物比例摸索結果 隨著β-actin引物量與目的基因IL-2引物比例的調整,到IL-2/β-actin引物濃度為7∶1時,兩種基因擴增效率相近,條帶凈灰度比值約為1∶1。因此,IL-2與β-actin的引物比例選擇為7∶1。見圖2。

圖2 IL-2、β-actin基因同管擴增引物比例摸索結果的電泳圖

2.3 IFN-γ、β-actin同管擴增循環數摸索結果 電泳結果如圖3所示,在27個循環后,IFN-γ和β-actin mRNA出現梯度變化,到第35個循環時擴增條帶清晰,所以選擇35個循環為本試驗檢測IFN-γ時PCR擴增的循環數。

2.4 IFN-γ、β-actin基因同管擴增引物比例摸索結果 將β-actin引物與IFN-γ基因引物放在一起擴增,隨著β-actin引物量的遞減,條帶也越來越淡,當IFN-γ/β-actin引物濃度比為5∶1 時,二者 β-actin 條帶灰度與條帶灰度大約為1∶1。見圖4。

圖4 IFN-γ、β-actin基因同管擴增引物比例摸索結果的電泳圖

2.5 芪藍四君子湯對雛雞小腸IL-2 mRNA表達的影響 在整個試驗過程中,芪藍四君子湯組IL-2 mRNA表達量普遍高于免疫對照組,其中20日齡時,芪藍四君子湯各劑量組豐度與免疫對照組相比均差異極顯著(P＜0.01)；在40日齡時,中,低劑量芪藍四君子湯可顯著提高小腸IL-2 mRNA豐度(P＜0.05)；到60日齡時,3個劑量組芪藍四君子湯均極顯著高于免疫對照組(P＜0.01)。見圖 5、6。

圖5 芪藍四君子湯對IL-2mRNA表達豐度變化的電泳圖

2.6 芪藍四君子湯對雛雞小腸IFN-γ mRNA表達的影響 在試驗初期20日齡時,空腸中IFN-γ mRNA的豐度最高,40、60日齡時依次逐漸下降。其中20日齡時,高劑量組IFN-γ mRNA表達量與單獨新城疫免疫組相比差異極顯著(P＜0.01),同時中劑量組可顯著提高IFN-γ mRNA的豐度(P＜0.05)；40日齡時,只有中劑量組可顯著提高IFN-γ mRNA的豐度(P＜0.05),其余各組差異不顯著。見圖7、圖8。

圖6 空腸內IL-2 mRNA相對表達值

圖7 芪藍四君子湯對IFN-γ mRNA表達豐度變化的電泳圖

3 討論

圖8 空腸內IFN-γ mRNA相對表達值

大量報告顯示,中藥以及成分不僅能通過影響免疫細胞的功能而發揮其免疫調節作用,也能通過調細胞因子的表達、分泌從分子水平作用于機體的免疫系統。其中儲岳峰[9]等報道黃芪多糖、淫羊藿多糖、蜂膠黃酮等均能在體內或體外促進 ConA誘導的 T淋巴細胞產生IL-2；Che-Ming Hung[10]等報道,口服銀翹散能顯著提高ConA誘導的T淋巴細胞產生IL-2和INF-γ。以上這些研究主要集中在外周血淋巴細胞和單核細胞受刺激后短時間內其細胞因子mRNA表達水平的變化。而本試驗與此不同,直接提取了組織(空腸)中mRNA,檢測雛雞口服芪藍四君子湯后不同日齡腸道中Th1型細胞因子的變化,從而更靈敏,更直接的反應了雛雞口服芪藍四君子湯后的局部免疫狀態。本試驗選擇表達穩定的β-actin作為內標與細胞因子引物同時擴增,用來校正不同樣本之間的差別。試驗中筆者通過調整兩對引物之間的比例來限制內標的過度擴增,而且試驗中發現目的條帶凈灰度并沒有因為β-actin引物的變化而出現競爭性梯度變化,說明內標和目的條帶之間沒有發生干擾,半定量RT-PCR測定雛雞小腸細胞因子mRNA豐度的方法建立。

當前,國內外對雞IL-2的研究表明,IL-2是引起T細胞增殖的主要細胞因子,對一般的免疫應答起到良好調節作用[11]。它具有促進T、B淋巴細胞的增殖和分化,增強單核細胞以及NK細胞的殺傷活性等免疫調節功能。IL-2的這種免疫調節功能,還表現在能夠增強疫苗誘導的免疫反應,誘導機體產生細胞免疫,非特異增強機體體液免疫,從而全面提高機體免疫功能。因此,對小腸中IL-2 mRNA進行檢測能直接反映雛雞腸道的免疫功能。本試驗結果表明,芪藍四君子湯配合新城疫弱毒疫苗使用,能顯著提高雛雞小腸中IL-2 mRNA的豐度,增強雛雞腸黏膜的免疫功能,對雛雞腸道起到良好的保護作用。

IFN-γ是Th1細胞分泌的一種具有特征性的細胞因子,在調節機體免疫應答、抗腫瘤細胞增殖和抗病毒中具有重要作用[12]。此外IFN-γ對MHC II成熟以及抗原呈遞等有明顯促進作用[13],因此也是衡量機體細胞免疫水平的一個重要標志[14]。本試驗以雞新城疫弱毒疫苗免疫雞后,到20日齡時(即免疫后第6天),所有免疫組IFN-γ mRNA的表達量顯著高于非免疫對照組,這與Yun[14]及王賽[15]的結果相似。說明口服新城疫弱毒疫苗后,抗原可以直接刺激腸道淋巴細胞,使其激活、增殖最終擺脫IFN-γ抑制狀態、使其獲得表達。在試驗前期芪藍四君子湯對IFN-γ mRNA的豐度有明顯的增強作用,且在一定范圍內藥效與用藥量呈現正相關關系。而到試驗后期芪藍四君子湯各組IFN-γ的表達水平較低。推測IFN-γ mRNA可能在免疫初期表達較多,隨后迅速轉錄為蛋白質形式發揮作用,因而造成后期IFN-γ mRNA表達不顯著。

總之,本試驗以IL-2和IFN-γ mRNA表達水平為指標,探索了該中藥復方增強免疫的分子機理,由試驗結果來看,芪藍四君子湯的免疫增強作用與其在轉錄水平上促進Th1型細胞因子的表達有關。提示這可能是芪藍四君子湯增強機體免疫力和發揮免疫增強作用的重要機制之一,但是細胞因子基因的轉錄和表達受到多種因素的綜合調控,并且細胞因子之間作用效果、作用途徑也不盡相同。因此對芪藍四君子湯的免疫機理的探索還應該與其他免疫效應如免疫細胞活性指標聯合,綜合分析,這為下一步的工作提供了重要啟示。