川續斷水煎劑對小鼠血清中免疫球蛋白和細胞因子的影響

李顏桃,張 雷,2,張明璀,王婷婷,唐 濤,馬 躍,3,4,曹立亭,3,4

(1.西南大學動物科學學院,重慶 榮昌 402460；2.貴州省畢節市七星關區農牧局,貴州 畢節 551700；3.重慶市獸醫科學工程研究中心,重慶 榮昌 402460；4.西南大學中獸醫藥研究所,重慶 榮昌 402460)

川續斷是川續斷科(Dipsacaceae)川續斷屬(Dipsacus)植物川續斷(Dipsacus asperoides C.Y.Cheng et T.M.Ai)的干燥根,主要分布于中草藥資源豐富的四川等地,其性微溫,味苦辛,歸肝、腎經,具有補肝腎、強筋骨和調血脈等功效[1]。《神農本草經》將其被列為上品,記載本品主傷寒,補不足,金瘡,癰瘍,折跌,續筋骨,婦人乳難,久服益氣力；現代醫學研究表明,續斷具備增強免疫力、抗氧化、消炎、抗病毒等藥理作用；臨床上常用于治療肝腎不足、腰肢痿軟、筋傷骨折、胎動不安等疾病。川續斷化學成分較復雜,主要含有的化學成分為揮發油類、生物堿類、環烯醚萜類、三萜皂苷類[2]。已有研究證實[3],川續斷水煎液經離心醇沉后得到的多糖具備刺激淋巴細胞的抗補體活性和致有絲分裂的作用；石扣蘭[4]研究表明,一定劑量川續斷水煎劑灌胃可提高小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能；趙連根[5]研究表明,川續斷對遲發型超敏反應有抑制的作用,可使免疫抑制小鼠血中的白細胞總數恢復到正常水平。王一濤[6]研究表明,川續斷能顯著增強機體體液免疫功能,對機體單核吞噬細胞功能有一定促進作用。

據以往研究,川續斷對骨損傷、骨質疏松、成骨細胞增殖及免疫功能、抗炎抗過敏、子宮增重等具有影響。近年來國內外對川續斷研究主要集中于化學成分提取測定及對骨代謝的影響等方面,對川續斷在免疫方向的研究報道相對較少。本實驗選取川續斷水煎劑灌胃小鼠,觀察其血清中IgA、IgG、IgM、細胞因子 IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ 和 TNF-α 含量的變化,探究川續斷增強動物免疫功能的機制,并為研發以川續斷為基礎的新型中草藥免疫增強劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物 中藥川續斷,購自重慶泰爾森制藥有限公司。

1.2 實驗動物 昆明系小鼠,雌雄各半,體重18～23 g,委托西南大學榮昌校區實驗動物平臺統一訂購。

1.3 檢測試劑盒 小鼠血清 IgA、IgG、IgM、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ 和 TNF-α 檢測試劑盒,購自南京建成生物工程有限公司。

1.4 方法

1.4.1 川續斷水煎劑的制備 準確稱取川續斷飲片200 g,用1 000 mL蒸餾水浸泡1 h后,先文火煎煮1 h,過濾后同樣方法二次煎煮。將兩次藥液合并后,減壓濃縮至相當于生藥量2 g/mL的藥液,4℃保存備用。

1.4.2 實驗動物及分組 選取昆明系清潔級小鼠40只,雌雄各半,體重18～22 g,隨機分為5組,每組8只,禁食12 h后,分別按10 g/kg·bw(組A)、20 g/kg·bw(組 B)、30 g/kg·bw(組 C)、40 g/kg·bw(組D)灌以終濃度為2 g/mL的川續斷水煎劑和生理鹽水(對照組),連續給藥7 d,給藥劑量見表1。

表1 試驗分組及給藥

1.4.3 小鼠血清中免疫球蛋白及細胞因子的檢測 于末次給藥后7 d,對小鼠摘除眼球取血,分離血清,于-20℃保存備用,測定各組試驗小鼠血清中 IgA、IgG、IgM、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ 和 TNF-α含量,具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 對小鼠血清中IgA的影響 從圖1中可知,與對照組相比,川續斷水煎劑灌胃后均可提高試驗小鼠血清中IgA水平(P＜0.05或P＜0.01),其中以10 g/kg·bw劑量效果最佳。

圖1 血清中IgA濃度(μg/mL)的變化

2.2 對小鼠血清中IgG的影響 從圖2中可知,20、30、40 g/kg·bw川續斷水煎劑灌胃后均能不同程度地升高血清中IgG的水平(P＜0.05或P＜0.01),其中以20 g/kg·bw劑量效果最佳。

2.3 對小鼠血清中IgM的影響 從圖3中可知,與空白對照組相比,不同劑量的川續斷水煎劑灌胃后均能顯著升高血清中IgM水平(P＜0.05),但各劑量組間差異不顯著。

2.4 對小鼠血清中IL-2水平的影響 從圖4中可知,與空白對照組相比,不同劑量的川續斷水煎劑灌胃后均能顯著升高血清中IL-2水平(P＜0.05),但各劑量組間差異不顯著。

圖2 血清中IgG濃度(mg/mL)的變化

圖3 血清中IgM濃度(μg/mL)的變化

圖4 血清中IL-2濃度(ng/L)的變化

2.5 對小鼠血清中IL-4水平的影響 從圖5中可知,與空白對照組相比,不同劑量的川續斷水煎劑灌胃后均能顯著降低血清中IL-4水平(P＜0.05),但各劑量組間差異不顯著。

2.6 對小鼠血清中IL-10水平的影響 與對照組相比,不同劑量的川續斷水煎劑灌胃后均能顯著降低血清中IL-10水平(P＜0.05),以20 g/kg·bw劑量組最明顯,但各劑量組間差異不顯著,見圖6。

圖5 血清中IL-4濃度(pg/mL)的變化

圖6 血清中IL-10濃度(pg/mL)的變化

2.7 對小鼠血清中IFN-γ水平的影響 從圖7中可知,與空白對照組相比,不同劑量的川續斷水煎劑灌胃后均能顯著升高血清中IFN-γ水平(P＜0.05),但各劑量組之間統計學比較差異不顯著。

圖7 血清中IFN-γ濃度(pg/mL)的變化

2.8 川續斷水煎劑對小鼠血清TNF-α水平的影響

從圖8中可知,與空白對照組相比,不同劑量的川續斷水煎劑灌胃后均能顯著升高血清中TNF-α水平(P＜0.05),但各劑量組之間差異不顯著。

圖8 血清中TNF-α濃度(ng/L)的變化

3 討論

免疫球蛋白是一組由B細胞受到抗原刺激后增殖分化成的漿細胞產生,具有抗體活性的蛋白質,依據其化學結構和抗原性差異可分為IgA、IgD、IgE、IgG和IgM五類[7]。IgA分為血清型和分泌型兩種,可介導調理吞噬作用、發揮抗體依賴性細胞介導的細胞毒性作用(ADCC),同時也是機體黏膜免疫防御系統的重要成分,是防止病原體入侵機體的第一道“屏障”[8]。IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白,是機體抗感染免疫的主力,能夠中和細菌毒素的毒性,促進單核巨噬細胞的吞噬作用,與病毒結合后使其失去感染宿主細胞的能力。IgM是抗原刺激誘導機體體液免疫應答中最先產生的免疫球蛋白,具有抗菌、抗病毒、中和毒素等生物免疫活性,在機體抗感染免疫早起發揮著重要作用。本試驗發現,川續斷水煎劑能提高小鼠血清中IgA、IgG和IgM的含量。提示川續斷可通過提高血清中免疫球蛋白水平,從來調節機體的免疫系統,增強機體免疫功能。

在細胞免疫中,T淋巴細胞處于中心地位[9]。Th細胞前體(Th cell Precursor)可在抗原的刺激下,分化為中間階段的Th0細胞,進而選擇性分化為Thl或Th2細胞[10]。Thl淋巴細胞用于誘導細胞免疫,分泌的細胞因子主要有 IL-2、IL-12、IFN-γ和TNF-α等；Th2細胞主要功能是刺激B淋巴細胞增殖參與機體的體液免疫,分泌的細胞因子主要有IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等。Th1細胞所分泌的細胞因子對Th2細胞的增殖活化存在抑制作用,反之,Th2細胞分泌的IL-4、IL-10也可抑制Thl細胞的增殖活化,這兩種細胞在免疫反應中發揮的作用是相互排斥的。IL-4由分化的TH2細胞產生,也是其極化的關鍵指導性信號。事實上,驅動和維持TH2細胞分化所涉及的許多途徑取決于IL-4的誘導[11]。有研究已經證實,IL-12可促進Th0細胞向Th1細胞分化[12],誘導Th1類細胞合成IFN-成,而IL-10是IL-12的主要生理性抑制劑,在Th1類細胞分化中負向調節作用[13]。在Th1處于的優勢狀態,IL-10受到抑制。本試驗結果表明,川續斷水煎液在10～40 g/kg濃度范圍內能顯著升高小鼠血清TNF-α的水平(P＜0.05),與李賢讓[14]在續斷總皂苷在治療骨關節炎模型的作用機制中發現,與正常組相比,模型組關節滑液中TNF-α表達量明顯升高(P＜0.01)的結論相一致。試驗還發現川續斷水煎劑在10～40 g/kg濃度范圍內,能顯著提高血清中Th1類細胞因子IL-2、IFN-γ水平,顯著抑制Th2類細胞因子IL-4和IL-10的分泌,使機體細胞免疫以Th1類細胞處于優勢應答狀態,增強了機體非特異性細胞免疫功能,這與詹光杰[15]等報道,五鶴續斷能夠提高衰老小鼠IL-2表達水平,促進T淋巴細胞的增殖,從而提高衰老機體的免疫力的結果相符。這可能是由于增強了T淋巴細胞的轉化功能,并使Th0淋巴細胞更多地向Th1細胞分化,而不是向Th2分化。而對于川續斷水煎劑是如何誘導T淋巴細胞Th1細胞分化的有關基因轉錄和信號轉導機制,有待進一步研究。