肉雛鵝源多殺性巴氏桿菌分離鑒定與致病性試驗

劉 燕

(河南農業職業學院牧業工程學院,河南 中牟 451450)

多殺性巴氏桿菌(Pm)是畜禽養殖中常見病原菌之一,該菌可以感染多種動物及人,動物感染后可以引起禽霍亂、豬肺疫和牛出血性敗血癥等多種疾病[1]。鵝巴氏桿菌病該病由多殺性巴氏桿菌引起的一種急性、高度接觸性、敗血性傳染病,又稱鵝霍亂,該病可以感染不同日齡的鵝,尤其對雛鵝較易感,多數呈急性敗血癥型,具有發病急、死亡快特點,發病率高達35%以上,死亡率高達70%以上,當與其他疾病混合感染后,其死亡更高,該病成為養鵝業主要傳染性疾病之一,嚴重影響著我國養鵝業發展[2-4]。目前,對多殺性巴氏桿菌沒有有效的疫苗進行預防,主要使用抗菌藥物進行預防與治療,在養殖過程中由于抗菌藥物的不合理使用,多殺性巴氏桿菌多重耐藥越來越嚴重,應引起重視。

2018年9月,中牟地區某一肉鵝規模化養殖場,14日齡肉雛鵝出現呼吸困難、腹瀉、個別呈現急性死亡。無菌采集病死肉雛鵝心血、肺臟、肝臟等病料組織中分離到1株病原菌,被鑒定為多殺性巴氏桿菌,本試驗對分離的多殺性巴氏桿菌進行血清型鑒定、致病性檢測及耐藥性分析,為該病的防治提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 病料來源 中牟地區某一肉鵝規模化養殖場,14日齡肉雛鵝出現呼吸困難、腹瀉、個別呈現急性死亡。無菌采集病死肉雛鵝心血、肺臟、肝臟等病料組織。

1.2 主要試劑與儀器 MH瓊脂培養基、普通營養肉湯,均購自北京陸橋生化試劑有限公司；美蘭染色液試劑盒,購自青島海博生物技術有限公司；ID32E腸道菌鑒定試條,購自bioMerieuxsa公司；小牛血清,購自四季青公司；藥敏紙片,購自北京天壇藥物生物技術開發公司；DL-2-000 Marker,購自北京中科瑞泰生物有限公司；2×Taq Marker Mix,購自北京康為世紀生物科技有限公司；全自動細菌生化鑒定系統(VITEK2型)由法國生物梅里埃公司生產；隔水式恒溫培養箱由上海恒科學儀器有限公司生產；7%綿羊脫纖血液瓊脂培養基由本實驗自制由本實驗提供。

1.3 實驗動物 1日齡健康肉雛鵝60只,中牟地區某一肉鵝規模化養殖場提供,在河南農業職業學院牧業工程學院實習基地養殖至14日齡進行試驗。

1.4 細菌分離與培養 采集病死肉雛鵝心血、肺臟、肝臟等病料組織無菌條件下接種于7%綿羊脫纖血液瓊脂培養,37℃恒溫培養12～18 h,選取單個優勢菌落接種劃含有10%小牛血清的普通培養基培養后,挑取單個的優勢菌落接種在含10%小牛血清營養肉湯中純化培養,取純化培養的分離菌株進行美藍染色鏡檢。

1.5 細菌的生化特性試驗 取純化培養的分離菌株,通過比濁法調整菌液濃度為0.5個麥氏濁度,按照說明加到ID32E腸道菌鑒定試劑條中進行培養,用全自動細菌生化鑒定系統對分離菌株進行生化試驗。

1.6 細菌的PCR鑒定與測序 參考文獻[5],根據多殺性巴氏桿菌基因序列設計特異性引物Kmt：P1 5′-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3′,P2 5′-GCTGTAAACGAACTGCCAC-3′由上海生工生化有限公司合成；預期擴增片段大小為457 bp。采用水煮法提取分離菌株的基因組DNA,以提取的基因組DNA為模板,多殺性巴氏桿特異性引物經行PCR鑒定。PCR擴增反應體系(50 μL)：2 × Taq Marker Mix 25 μL,上、下游引物各 2 μL,DNA 模板 2 μL,ddH2O 19 μL。反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性50 s,59.5℃退火50 s,72℃延伸50 s,72℃中延伸10 min,共30個循環。將目的基因片段回收并送生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定,測序結果與Gen-Bank數據庫中登錄參考基因序列進行同源性比較。

1.7 細菌致病性試驗 參考文獻[6]設計致病性試驗,并計算LD50。選擇體重相近健康肉雛鵝60只隨機分成6組,每組10只,1～5組的每只試驗肉鵝腹腔注射分離菌株菌液0.2 mL,1～4組腹腔注射分離菌株菌液濃度分別為1.0×104CFU/mL、1.0×105CFU/mL、1.0 × 106CFU/mL、1.0 × 107CFU/mL、1.0×108CFU/mL,6組為空白對照組給予等量的無菌的生理鹽水,攻毒12 h后觀察7 d,并記錄每個試驗組肉鵝發病情況及死亡數據,對死亡的試驗鵝鴨進行細菌學鑒定,用改良寇氏法計算分離菌株的LD50。

1.8 細菌的血清型鑒定 參考文獻[7],設計多殺性巴氏桿血清型基因序列設計引物(表1),由上海生工生化有限公司合成,以提取的基因組DNA為模板,用PCR方法鑒定多殺性巴氏桿血清型。

表1 多殺性巴氏桿血清型引物序列設計

1.9 藥敏試驗 藥敏試驗按照美國臨床檢驗標準委員會(NCCLS)推薦的標準K-B紙片法進行操作和結果判斷[8]。

2 結果分析

2.1 細菌分離與培養結果 分離菌株7%的綿羊脫纖血液瓊脂培養基長出灰白色的、圓形的、濕潤的、均勻一致的露珠樣小菌落；在含10%小牛血清普通營養瓊脂上可見灰白色、圓形的菌落,在不含10%小牛血清普通營養瓊脂生長貧瘠。美蘭染色鏡檢可見分離菌株呈卵圓形,中央不易著色兩極濃染球桿菌(見圖1)。

圖1 分離菌美藍染色鏡檢結果 (1 000×)

2.2 細菌的生化鑒定結果 分離菌株分解葡萄糖、果糖、單奶糖、蔗糖和甘露糖,產酸不產氣；可產生硫化氫,能形成靛基質,MR和V-P試驗均為陰性；接觸酶和氧化酶試驗均為陽性。經全自動細菌生化鑒定系統檢測分析,鑒定結果為多殺性巴氏桿菌,結果見表2,評定結果合格率為100.0%。

表1 生化試驗鑒定結果

2.3 細菌的PCR鑒定與測序 用多殺性巴氏桿菌特異性引物對分離菌株Kmt 2基因PCR擴增出大約為457 bp左右的的目的條帶,與報道的一致(見圖2)。將分離菌株的測序結果進行拼接后與GenBank中登錄的多殺性巴氏桿菌基因序列同源性在98.9%～100%之間,因此,分離菌株被鑒定為多殺性巴氏桿菌。

圖2 分離菌株Kmt基因PCR鑒定結果

2.4 細菌致病性試驗結果 1-5組試驗試驗肉鵝在攻毒后的24 h～96 h,出現不同程度死亡,對死亡的試驗肉鵝進行細菌學鑒定,在死亡的試驗肉鵝體內分離到了大腸桿菌菌,直到試驗結束(7d),對照組試驗肉鵝健康存活,1-5組死亡率分別為40%、70%、90%、100%、100%。用改良寇氏法計算致病性多殺性巴氏桿菌的LD50為5.86×106CFU/mL。

1.5 細菌的血清型鑒定結果 用多殺性巴氏桿菌血清型引物對分離菌血清型進行PCR檢測,分離菌株擴增出A血清型大約為1058 bp左右的的目條帶(圖3),測序結果與與GenBank DNA序列數據庫中已發表的多殺性巴氏桿菌莢膜A型菌株參考菌株同源性為99.9%,分離菌為多殺性巴氏桿菌莢膜型A型。

圖3 多殺性巴氏桿菌血清型PCR鑒定結果

2.5 藥敏試驗結果 由表2可知,從肉雛鵝體內分離到的致病性多殺性巴氏桿菌對頭孢曲松、頭孢噻呋、強力霉素、恩諾沙星、環丙沙星、林可霉素6種藥物高度敏感；對新霉素、慶大霉素、氟苯尼考、丁胺卡那霉素、大觀霉素等5種藥物中度敏感；對氨芐西林、阿莫西林、磺胺間甲氧嘧啶、紅霉素、多粘菌素等5種藥物耐藥。

表2 藥敏試驗結果

3 討論

近幾年,隨著我國養殖業的發展,肉鵝養殖數量越來越多,國內關于鵝巴氏桿菌病的報道逐漸增多,該病發病急、死亡快,其發病率和死亡率都很高特點,成為危害養鵝業主要細菌性傳染疾病之一[9]。本試驗從中牟地區某一肉鵝規模化養殖場中14日齡病死肉雛鵝心血、肺臟、肝臟等病料組織中分離到1株病原菌,被鑒定為多殺性巴氏桿菌,通過人工感染肉雛鵝驗證其致病性,結果顯示,從肉雛鵝體內分離到的多殺性巴氏桿菌對14日齡的雛鵝具有很強的致病性,其LD50為5.86×106CFU/mL。本試驗分離的肉鵝源致病性多殺性巴氏桿菌致病性均高楊楠等[6]、張召興等[10]報道的。可能與分離的區域有關。巴氏桿菌傳播途徑廣泛,與外界環境的有很大關系,當外界條件該病時,可以誘發該病發生與流行。在肉鵝的養殖過程中應該引起重視。

多殺性巴氏桿菌抗菌結構復雜,其中莢膜抗原主要包括A、B、D、E和F5種,脂多糖抗原有16種,不同地區不同的宿主流行的血型也存在差異性。本試驗結果顯示,分離到肉鵝源致病性多殺性巴氏桿菌莢膜抗原血清型為A型。許多研究鵝源多殺性巴氏桿菌莢膜抗原血清型為A型。莢膜抗原血A型多殺性巴氏桿菌可能成為鵝源多殺性巴氏桿菌流行的主要血清型。在肉鵝養殖過程中,沒有用多殺性巴氏桿菌多價疫苗進行預防,導致該病的發生與流行,臨床中主要用抗菌藥物進行防控,抗菌藥物不合理使用,導致嚴重的耐藥性,降低治療效果。本試驗藥敏試驗結果表明,分離菌株對對頭孢曲松、頭孢噻呋、恩諾沙星等6種藥物高度敏感；對其他藥物有不同的程度耐藥性。因此,當發生該病時,應該選擇敏感藥物合理使用,減少抗藥性產生,同時還要加強平時的飼養管理,注意養殖環境中的消毒。