牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體膠體金檢測試紙條的制備

梅 力,李永清,宋彥軍,高曉龍,李 佳,楊春江,韋海濤,于在江,王 林,馮小宇

(1.北京市動物疫病預防控制中心,北京 大興 102629；2.北京市農林科學院畜牧獸醫研究所,北京 海淀 100097；3.北京納百生物科技有限公司,北京 大興 100176)

牛傳染性鼻氣管炎(IBR),是由牛皰疹病毒1型(BHV-1)引起的牛的一種急性接觸性傳染病。臨床上分呼吸道、生殖道、腦、結膜等多種感染類型。呼吸道型以呼吸道黏膜發炎、水腫、出血和壞死為特征；生殖道型以生殖器官出現小膿包病變為特征,表現為膿皰性外陰陰道炎和龜頭包皮炎,成年母牛還常伴有乳房炎、流產、受孕率降低和產奶量下降等癥狀；腦膜炎型主要發生于犢牛,表現共濟失調、角弓反張等腦炎癥狀；結膜炎型主要表現眼結膜充血、水腫和點狀壞死,眼部出現漿液性或膿性分泌物。該病死亡率較低,多呈亞臨床經過,但易繼發細菌感染,導致支氣管肺炎等嚴重呼吸道疾病。王志亮等人通過對來自北京、天津、陜西、山西、山東、新疆、河南、河北等地l1個奶牛場的996份血清樣品進行IBRV抗體檢測,共檢測出陽性血清120份,群陽性率為 77.8%,最高陽性率達55.0%,結果顯示,大部分牛場都存在不同程度的IBRV感染。由此可見,牛傳染性鼻氣管炎發病率較高,且在我國分布極廣[1]。

牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)基因組為線性雙股RNA,整個基因組編碼33個結構蛋白和15個非結構蛋白[2]。所有蛋白中4個糖蛋白、gC、gD和gE是IBRV的主要抗原,而gD蛋白被認為是病毒粒子表面和病毒感染細胞的主要分子,是IBRV的主要結構蛋白,是IBRV復制的必需基因,是刺激機體產生中和抗體的主要糖蛋白,它不但能誘導體液免疫,還可誘導細胞免疫[3],是目前IBRV特異性診斷的主要抗原。

IBRV的診斷檢測主要依賴于經典的病毒分離培養[4]、免疫熒光[5]、ELISA[6-7]和分子生物學檢測手段如PCR[8]等,但這些方法均需依賴專業儀器設備及實驗人員的精細操作,且成本高昂,無法在基層養殖場開展。膠體金技術自1971年被引入到免疫化學中,已經作為一種免疫標記技術而被廣泛使用。膠體金作為標記物不存在內源酶干擾及放射性同位素污染問題,且利用不同顆粒大小的膠體金還可以做雙重甚至多重標記,使定位更加精確。由于膠體金作為標記物有很多優點,因此自該技術問世以來在國內外的許多研究領域中得到了迅速發展[9]。本試驗利用昆蟲細胞-桿狀病毒表達體系重組表達gD蛋白抗原,以此建立了牛傳染性鼻氣管炎病毒雙抗原夾心免疫膠體金快速檢測方法,為疫病防控提供了有效檢測手段,可以極大地改善當前IBRV的防控狀況。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品 實驗用標準陰、陽性血清來源于中國獸醫藥品監察所,牛傳染性鼻氣管炎病毒及血清樣本由本實驗室保存。

1.2 主要儀器設備 PCR儀(Thermo公司)；純水儀(密理博公司)；培養箱(上海博訊實業有限公司)；紫外分光光度計(上海精密儀器儀表有限公司)；凝膠成像系統(北京昊諾斯科技有限公司)；天平(賽多利斯(上海)貿易有限公司)；蛋白純化儀(GE primer公司)；膠體金切條機(上海韓感電子有限公司)；劃膜儀(Biodot公司)；超聲破碎儀(昆山超聲儀器有限公司)。

1.3 主要試劑及材料 質粒pUC-gD(基因片段包括IBRV的gD堿基)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；DH5α感受態細胞,購自北京天根生物工程技術有限公司；桿狀病毒表達載體pFastBac HT-B和DH10Bac感受態細胞由本實驗室保存；羊抗牛二抗,購自北京中杉金橋生物技術有限公司；其他試劑和材料包括：氯金酸(Sigma公司)；蛋白穩定劑(上海西寶生物科技有限公司)；NC膜及其他膠體金材料(上海捷寧生物工程有限公司)。

牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體ELISA檢測試劑盒(貨號：99-41299,美國IDEXX產品)。

其他試劑,均購自國藥集團化學試劑北京有限公司。

1.4 方法

1.4.1 gD重組蛋白桿狀病毒系統表達 參照Gen-Bank中登陸的IBRV基因序列設計引物,用于克隆p80基因片段,在上、下游引物中引入了EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。gD基因片段以pUC-gD質粒為模板,用PCR方法擴增。反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性45 s,退火條件為55.6℃ 45 s,72℃延伸2 min,擴增30個循環；72℃延伸7 min；4℃終止反應。純化的PCR產物與表達載體pFastBac HT-B分別進行雙酶切后,用T4 DNA連接酶4℃連接過夜,連接產物轉化DH5α感受態細胞。陽性重組質粒命名為 pFastBac HT-gD。將陽性重組質粒轉座DH10Bac感受態細胞,通過用KTG抗生素和藍白斑篩選陽性克隆,提取Bacmid,轉染SF9昆蟲細胞,觀察轉染后細胞病變并收集重組桿狀病毒。培養上清和細胞裂解液煮樣后進行SDS-PAGE電泳,通過濕法轉印至NC膜上,進行Western Blot檢測。用1∶100稀釋的IBRV陽性牛血清作為一抗,同時設陰性牛血清對照,37℃孵育2 h,TBST洗滌3次,10 min/次,將HRP標記的兔抗牛抗體作為二抗,用TBST進行1∶5 000倍稀釋,37℃孵育1h,再用TBST洗滌3次,10min/次。DAB顯色,去離子水終止反應。拍照保存檢測結果。

1.4.2 gD蛋白純化鑒定 將重組桿狀病毒以MOI 0.1感染SF9昆蟲細胞,4 d后以5 000 r/min離心10 min,收集上清。目的蛋白的純化參照Ni-NTA純化系統說明書進行,純化后蛋白用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定濃度并分裝,-80℃保存備用。

1.4.3 gD蛋白膠體金標記 采用檸檬酸三鈉還原法制備得到40 nm范圍的膠體金顆粒溶液,調節pH值至9.0備用。取一定量的膠體金顆粒溶液,置于磁力攪拌器上,將純化后的gD蛋白抗原用PBS按照1∶2 000的比例稀釋后加入膠體金溶液中攪拌反應60 min,將PEG 20 000溶液加入混合反應液中,使PEG的最終濃度約為1%,置于冷凍離心機(4℃)上慢速(速度為11 000r/min～13 000 r/min)離心10 min后棄去上清液。將下層沉淀用PBS反復洗滌并繼續離心棄去多余上清液。將沉淀物以PBS緩沖液重新懸浮,使最終的蛋白濃度約為50 μg/mL左右,保存于4℃備用。

1.4.4 IBRV雙抗原夾心膠體金檢測方法的建立

1.4.4.1 金標墊的制備 金標墊采用聚酯膜,經含有1%BSA和1%吐溫-20的PBS處理后,將制備好的膠體金標記抗原按照40 μL噴涂,37℃烘干2 h備用。

1.4.4.2 樣品墊的制備 樣品墊采用聚酯纖維墊,采用自制含有表面活性劑的處理液浸泡后烘干備用。

1.4.4.3 檢測線和質控線包被 檢測線標記物為gD抗原,質控線標記物為羊抗牛二抗。分別將檢測抗原和羊抗牛二抗用含有1%BSA的PBS稀釋成濃度為0.8 mg/mL和1.2 mg/mL溶液,然后用Biodot劃膜儀噴涂于硝酸纖維膜上,37℃烘干1 h備用。

1.4.4.4 試紙條組裝 試紙條的組裝按照圖1模式進行。其中PVC背板、吸水墊為常規材料。組裝好的大板用切條機切成7 mm的裸條備用。

圖1 膠體金試紙條組裝圖

1.4.4.5 試紙條檢測 將待測樣本以PBS稀釋100倍后用于檢測。檢測時取200 μL稀釋好的樣本至反應微孔中,插入試紙條,確保金標端插入液面,計時5 min后觀察結果。陰性結果為質控線顯色,而檢測線不顯色；陽性結果為質控線顯色,檢測線也顯色。超過10 min觀察結果無效。

1.4.4.6 靈敏度試驗 將標準陽性血清用PBS按照 1∶10、1∶50、1∶100、1∶500、1∶1 000、1∶2 000 進行稀釋,用制備的試紙條進行檢測,以能夠檢測出的陽性血清的最高稀釋度作為本試紙條的靈敏度。

1.4.4.7 特異性試驗口蹄疫病毒(FMDV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)的陰性血清和陽性血清由本實驗室保存,用建立的膠體金試紙條對以上兩種病毒的陰、陽性血清進行特異性交叉試驗,同時設IBRV標準陰陽性血清對照,以評價該試紙條的特異性。

1.2.4.8 穩定性試驗 將制備的試紙條生產5個批次成品,分別置于-20℃、室溫、37℃持續保存7 d。7 d后取出,對稀釋100倍的標準陰、陽性血清進行檢測,單個樣本重復5次,以檢測結果的一致性判斷試紙條的穩定性。

1.4.4.9 與其他試劑盒的比對試驗 選取112份牛血清樣品,使用建立的膠體金試紙條和IDEXX牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體ELISA檢測試劑盒同時進行檢測,分別計算陽性符合率、陰性符合率和總符合率,對試紙條的檢測效果進行評估。

2 結果與討論

2.1 gD蛋白重組表達及鑒定 對陽性重組質粒pFastBac HT-gD進行PCR鑒定,牛傳染性鼻氣管炎病毒gD基因片段大小為1 170 bp,以提取的重組質粒為模板,進行PCR檢測,獲得了與預期大小一致的1 170 bp特異性目的條帶,如圖2所示。

圖2 重組質粒PCR擴增電泳圖

經SDS-PAGE檢測重組表達的gD蛋白,均可見誘導表達重組菌株比誘導的空載體在57 kD處多出一條明顯的表達條帶,且與預期大小一致,如圖3所示。

重組gD蛋白經SDS-PAGE電泳后轉移至NC膜上進行免疫印跡檢測。檢測結果顯示,重組gD蛋白與IBRV陽性牛血清在預期的57 kD處出現特異性反應條帶,與陰性牛血清無特異性條帶,如中插彩版圖4所示,由此表明,重組表達的gD蛋白具有良好的抗原性。

圖4 Western Blot鑒定重組gD蛋白抗原性結果

2.2 gD蛋白膠體金標記 使用膠體金顆粒對制備的gD蛋白進行標記,調節蛋白終濃度為50 μg/mL,標記的gD蛋白可穩定保存于4℃也沒有發生沉淀現象,因此可用于后續試驗的標記。

圖3 重組gD蛋白SDS-PAGE鑒定圖

2.3 膠體金檢測方法的建立

2.3.1 膠體金檢測結果 膠體金試紙條對IBRV陽性血清和陰性血清的檢測結果如中插彩版圖5所示。其中A為試紙條的質控條線,B為陽性血清的檢測結果條線,C為陰性血清的檢測結果條線。

圖5 IBRV陰陽性血清的膠體金試紙條檢測結果示例

2.3.2 靈敏度試驗 將標準陽性血清用PBS按照1∶10、1∶50、1∶100、1∶500、1∶1 000、1∶2 000 進行稀釋,用制備的試紙條進行檢測,以能夠檢測出的陽性血清的最高稀釋度作為本試紙條的靈敏度。從表1可知,當標準陽性血清稀釋至1∶500時,膠體金試紙條的檢測結果為陽性,而稀釋至1∶1 000時,膠體金試紙條的檢測結果為陰性,表明本研究制備的膠體金試紙條的檢測靈敏度為標準陽性血清稀釋至 1∶500。

表1 IBRV抗體膠體金試紙條靈敏度試驗結果

2.3.3 特異性試驗 使用建立的膠體金試紙條對IBRV、FMDV、BVDV陽性血清和陰性血清進行檢測,除IBRV陽性血清外,其他檢測結果均為陰性,如表2所示,說明本試紙條特異性良好,可以特異地識別IBRV抗體。

表2 IBRV抗體膠體金試紙條特異性試驗結果

2.3.4 穩定性試驗 將5批次不同溫度儲存的試紙條分別用標準陽性血清和標準陰性血清進行檢測,結果如表3。檢測結果表明,低溫凍存對試紙條的檢測結果影響較大,而室溫和37℃對試紙條檢測結果無明顯影響,說明本試紙條具有較好的穩定性。

表3 IBRV抗體膠體金試紙條穩定性試驗結果

2.4 與國外試劑盒檢測結果對比 使用IDEXX牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體ELISA檢測試劑盒和建立的膠體金試紙條對112份牛血清樣本進行重復檢測,從結果中可看出使用膠體金試紙條檢測出陽性樣品60份,陽性檢出率為53.6%,檢測出陰性樣品52份,陰性檢出率為46.4%。而用IDEXX牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體ELISA檢測試劑盒檢測出陽性樣品62份,陽性檢出率為55.4%,檢測出陰性樣品為50份,陰性檢出率為44.6%。其中兩種方法檢測共為陽性的樣品為58份,共為陰性的樣品為48份,即陽性符合率為93.5%,陰性符合率為96.0%,總符合率為94.6%,可見制備的膠體金試紙條與商品化的ELISA試劑盒具有較高的符合率,結果見表4。

表4 IBRV抗體膠體金試紙條與IDEXX抗體檢測試劑盒符合率的比較

3 討論

牛傳染性鼻氣管炎自1955年首次報道以來,每年在全球各地都有感染報道出現[10],我國于1981年首次發現并報道了該病[11]。目前牛傳染性鼻氣管炎在不同國家和地區均呈現出不同程度的發病和流行,這給全球養牛業都造成了嚴重影響。該病在我國被認定為二類傳染病,也是國際動物貿易及進出境動物檢疫中的重點檢查疫病[12]。牛傳染性鼻氣管炎病毒是引起牛傳染性鼻氣管炎的主要病原,、gC、gD和gE蛋白是IBRV的主要病毒蛋白,其中gD蛋白又是牛傳染性鼻氣管炎病毒最主要的抗原蛋白,是刺激機體產生中和抗體的主要結構蛋白,丁國偉指出,抗gD蛋白的單克隆抗體能夠中和吸附在宿主細胞表面的病毒,并且中和滴度較高,因此可將gD蛋白作為牛傳染性鼻氣管炎亞單位疫苗和診斷試劑研制的首選蛋白[13]。

本研究構建了牛傳染性鼻氣管炎病毒gD重組蛋白表達菌株pET-28a(+)-IBRVgD/BL21(DE3),經過鑒定,其誘導表達的重組gD蛋白具有良好的抗原性和反應特異性。以此為基礎,本研究成果建立了檢測牛傳染性鼻氣管炎抗體的膠體金快速檢測試紙條,該試紙條與商品化ELISA試劑盒的檢測結果無顯著差異,且檢測時間更短,操作更方便,因此可以有效地應用于臨床快速檢測,將為疫病的凈化和防控提供有效工具。