四川省阿壩州牦牛和藏綿羊梨形蟲分子流行病學(xué)調(diào)查

鐘 維,杜雪梅,郝力力,袁東波,郭 莉,侯 巍,魯志平,莫 茜,陽愛國,毛清方,羅小麗,土登卓瑪

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川 成都 610041；2.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,四川 成都 610041；3.四川省石渠縣畜牧局,四川 石渠 627350)

梨形蟲病(泰勒蟲病和巴貝斯蟲病)是寄生于脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞或者其他細(xì)胞內(nèi)的蜱傳性寄生蟲病,可導(dǎo)致牛羊產(chǎn)生發(fā)熱、貧血、消瘦、黃疸和血紅蛋白尿等癥狀,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡,常給牛羊養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重制約牛羊養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。牦牛和藏綿羊是四川省阿壩州主要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物,也是當(dāng)?shù)鼐用裰饕慕?jīng)濟(jì)收入來源之一。近年來,對(duì)牦牛和藏綿羊疫病的防控主要集中于口蹄疫、布病以及小反芻獸疫等細(xì)菌性、病毒性傳染病,對(duì)牦牛和藏綿羊梨形蟲的調(diào)查一直是個(gè)空白。鑒于此,本試驗(yàn)針對(duì)梨形蟲18S rRNA基因設(shè)計(jì)通用引物,對(duì)牦牛和藏綿羊梨形蟲感染情況展開了調(diào)查,以確定阿壩州部分地區(qū)牦牛和藏綿羊梨形蟲感染率及蟲種。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 主要儀器設(shè)備和試劑：臺(tái)式高速離心機(jī)(eppendorf 5402型)；Biometra TAdvanced 96SG PCR儀、2×EasyTaq PCR Super Mix(北京全式金生物科技有限公司)；全血DNA小量試劑盒(臺(tái)灣Geneaid公司GS100)。

血液樣本：采集時(shí)間為2016年9月到2016年10月,由省動(dòng)物疫控中心負(fù)責(zé)采集,共采集抗凝血200份。由于條件所限,阿壩和金川只采集了牦牛血樣,小金只采集了藏綿羊血樣。樣本信息如下：牦牛血樣108份,其中紅原20份,阿壩24份,壤塘16份,金川48份；藏綿羊血液樣本92份,其中：紅原20份,壤塘24份,小金48份。所有樣本均來自牧區(qū)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 全血DNA的提取 使用Geneaid公司全血提取試劑盒,按照說明書進(jìn)行操作。

1.2.2 18S rRNA引物的設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)中采用巢式PCR方法行進(jìn)檢測。第一輪反應(yīng)中所用引物采用孫彩琴等[1]設(shè)計(jì)巴貝斯蟲和泰勒蟲通用引物序列如下,F1∶5′-GATAACCGTGCTAATTGTAGG-3′,R1：5′-ATCGTCTTCGATCCCCTAACT-3′；第二輪反應(yīng)引物 為 自 行 設(shè) 計(jì),序 列 如 下 F2：5′-AATTGTAGGGCTAATACATGTTCG-3′；R2： 5′-GAAAACATCCTT GGCAAATGCTTTCGC-3′,最終產(chǎn)物大小在750～810 bp之間。

1.2.3 梨形蟲18S rRNA序列的PCR擴(kuò)增、同源性分析及進(jìn)化樹構(gòu)建 PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；然后40個(gè)循環(huán)：94℃1 min,50℃30 s,72℃1 min；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物克隆后送華大基因科技服務(wù)有限公司測序。運(yùn)用Lasergene7.0軟件對(duì)所測得的序列拼接、比對(duì)和同源性分析,分子進(jìn)化樹用MEGA 7構(gòu)建。

2 結(jié)果

2.1 18S rRNA PCR檢測 從牦牛和藏綿羊全血基因組DNA中成功擴(kuò)增出梨形蟲18S rRNA目的條帶,片段大小約在800 bp,見圖1。

圖1 部分牦牛血液樣本PCR反應(yīng)后電泳圖

2.2 牦牛和藏綿羊梨形蟲感染率 牦牛和藏綿羊梨形蟲感染率如表1所示,其中牦牛感染率分別為紅原35%、壤塘100%、阿壩8.3%、金川8.3%,其中壤塘縣牦牛感染率最高；藏綿羊感染率分別為紅原60%、壤塘45.8%,小金95.8%,其中小金縣藏綿羊梨形蟲感染率最高。

表1 阿壩州牦牛和藏綿羊梨形蟲感染情況

2.3 序列比對(duì)、進(jìn)化樹構(gòu)建及分析 應(yīng)用Lasergene7.0軟件對(duì)克隆出的18S rRNA基因序列與其他泰勒蟲18S rRNA的序列進(jìn)行同源性分析(圖2),應(yīng)用Mega 6軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖3)。由圖2可見,來自阿壩、紅原、金川和壤塘的牦牛感染的梨形蟲均為中華泰勒蟲(圖2中對(duì)應(yīng)序號(hào)分別為10、11、12/15),4個(gè)地區(qū)序列之間同源性為100%,與報(bào)道自甘肅、河南的中華泰勒蟲(圖2中對(duì)應(yīng)序號(hào)分別為5、6、7)同源性為100%；來自小金、紅原和壤塘的藏綿羊(圖2中對(duì)應(yīng)序號(hào)分別為9、10、14)均感染呂氏泰勒蟲,其中壤塘和紅原18S rRNA基因同源性為100%,小金和紅原(壤塘)同源性為99.4%,與青海、寧夏等地報(bào)道的呂氏泰勒蟲同源性在97.8～99.8之間(圖2中對(duì)應(yīng)序號(hào)分別為1、2、3、20、21)。 從建立的進(jìn)化樹可以看出(圖3)牦牛感染的中華泰勒蟲與國內(nèi)報(bào)道的中華泰勒蟲甘肅、河南株位于同一分支,進(jìn)化關(guān)系比較近。藏綿羊感染的呂氏泰勒蟲與國內(nèi)外報(bào)道的呂氏泰勒蟲均處于同一分枝,進(jìn)化關(guān)系較近,但與青海株親緣關(guān)系更近,處于同一分支上。

圖2 泰勒蟲18S rRNA基因同源性比較

圖3 基于泰勒蟲18S rRNA的進(jìn)化樹分析

3 討論

阿壩藏族羌族自治州一直是牛羊梨形蟲病的流行區(qū)[2-3],最早在1974年就有關(guān)于牦牛梨形蟲病的報(bào)道,其中馬爾康縣5個(gè)鄉(xiāng)牦牛死亡率高達(dá)90%[4]。1985年4月,金川縣俄熱鄉(xiāng)和小金縣新橋鄉(xiāng)也發(fā)生梨形蟲病,20余天死牛338頭,其中牦牛309頭,占91%[5]。據(jù)羅光榮等調(diào)查[6],1987年以后,在壤塘、松潘、阿壩縣的半農(nóng)半牧區(qū),若爾蓋、紅原縣牧區(qū)呈地方性散發(fā)流行,理縣、九寨溝、汶川、茂縣僅在飼養(yǎng)牦牛的山原區(qū)有零星散發(fā)。2005年冬季,阿壩州紅原縣龍日、安曲等部分鄉(xiāng)的牦牛發(fā)生梨形蟲病,導(dǎo)致4% ～7%的牦牛死亡,給當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)造成較大損失[7]。

可感染牛的梨形蟲種類較多,包括環(huán)形泰勒蟲、中華泰勒蟲、雙芽巴貝斯蟲、牛巴貝斯蟲、分歧巴貝斯蟲以及大貝斯蟲等；可感染羊的梨形蟲包括莫氏巴貝斯蟲、羊巴貝斯蟲、泰氏巴貝斯蟲、綿羊泰勒蟲和山羊泰勒蟲等。然而,到目前為止,一直未見對(duì)阿壩州牦牛和藏綿羊感染梨形蟲種類的確切報(bào)道。本試驗(yàn)正是基于這一現(xiàn)狀,采用巢式PCR方法對(duì)阿壩州紅原、壤塘等5個(gè)縣來自牧區(qū)的牦牛、藏綿羊進(jìn)行了檢測,發(fā)現(xiàn)牦牛梨形蟲感染率為8.3% ～100%,感染蟲種單一,均為中華泰勒蟲；藏綿羊感染率為45.8% ～95.8%,感染蟲種單一,均為呂氏泰勒蟲。中華泰勒蟲是白啟等分離出的一種國內(nèi)新的泰勒蟲蟲種[8],致病力較弱,用18S rRNA基因?qū)ζ溥M(jìn)行發(fā)育關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)其與其他泰勒蟲有明顯的差異。本試驗(yàn)中,紅原、壤塘、金川和阿壩州牦牛均感染中華泰勒蟲,但均未發(fā)現(xiàn)有明顯的臨床癥狀,也間接說明中華泰勒蟲可能是一種較為溫和的血液原蟲。呂氏泰勒蟲傳播媒介為長角血蜱和青海血蜱[9],青海血蜱是我國的特有種,分布于我國西部高原,主要包括青海、甘肅.四川、云南、西藏和寧夏等省[10]；長角血蜱則也是一種常見蜱種,分布于我國大多數(shù)省區(qū)[10]。因此,阿壩州較高的羊呂氏泰勒蟲感染率(45.8%～95.8%)也可能和這兩種蜱的廣泛分布有關(guān)。

除此之外,采用巢式PCR鑒定蟲種的過程中,200份樣本中有107份只用第1對(duì)引物,即可擴(kuò)出目的條帶,剩下的樣本采用第2對(duì)引物擴(kuò)增后,也會(huì)出現(xiàn)較為明顯的目的產(chǎn)物。值得注意的是,本試驗(yàn)初期也曾采用Lorien等使用的方法[11](巢式PCR,目的基因18S rRNA,產(chǎn)物1 700 bp左右),但經(jīng)常會(huì)擴(kuò)出與目的片段大小相近的齒脊腎形蟲(Colpoda steinii)18S rRNA基因。經(jīng)分析,該蟲種廣泛分布于青藏高原沼澤濕地中,牛羊在自由采食過程中很容易污染被毛,加之采血過程中,條件所限,無法徹底清潔采血部位,很有可能導(dǎo)致污染血樣。所以,在孫彩琴等[1]第一對(duì)引物基礎(chǔ)上,自行設(shè)計(jì)了第2對(duì)引物,經(jīng)比對(duì)分析和臨床樣本測試,具有較好的特異性,徹底排除了齒脊腎形蟲造成的干擾。

綜上所述,本試驗(yàn)對(duì)阿壩州部分地區(qū)牦牛和藏綿羊梨形蟲感染情況和感染蟲種進(jìn)行了調(diào)查,提供了分子依據(jù)。后期擬進(jìn)一步擴(kuò)大調(diào)查范圍、樣本數(shù)量以及對(duì)傳播媒介蜱進(jìn)行充分調(diào)查,為摸清阿壩州牦牛和藏綿羊梨形蟲病基線提供技術(shù)支撐。