產氣莢膜梭菌α毒素C末端的二拷貝串聯表達與免疫原性分析

杜吉革,王 磊,薛 麒,朱 真,李啟紅,印春生,姚文生,康 凱,陳小云

(中國獸醫藥品監察所,北京 海淀 100081)

產氣莢膜梭菌能引起人類以及多種家畜家禽發病,不僅威脅著人類的健康,而且對畜牧業造成了巨大的經濟損失。根據4種主要致死性外毒素α(CPA)、β(CPB)、ε(ETX)和 ι(CPI),可將該菌分為A、B、C、D、E 5 個毒素型[1]。 其中,對養牛業危害最大的是A、C型和D型。在國外,牛的產氣莢膜梭菌病主要由C、D型菌引起,而在國內,牛的產氣莢膜梭菌病的病原主要是A型菌[8],病牛往往無任何前驅癥狀,而突然發病死亡[2-3]。為此,疫苗免疫是防制該病的有效手段。然而國內還沒有商品化的疫苗,雖然滅活疫苗在預防羊的產氣莢膜梭菌上,起到了一定的效果,但該類疫苗的制備過程冗雜,抗原成分復雜,有效抗原量較低。如大劑量的肌肉注射會破壞牛肉的品質。因此,提供安全、純凈、有效的抗原對未來預防該菌感染具有重要意義。

CPA是由產氣莢膜梭菌染色體基因 plc編碼[4],在A型毒株中表達水平最高[5]。成熟的CPA分為N-末端(1-246,CPAN)和 C-末端(247-370,CPAC)兩個結構域。其中,CPAN是CPA發揮酶活性的主要區域,而CPAC是毒素與細胞結合的主要區域[6]。研究表明,重組 CPA仍存在一定的毒力[7],而通過甲醛滅活后的CPA抗原性會明顯降低[8-10]。為此,無毒力的重組CPA的研制具有重要的意義。已有的研究表明,無毒力的CPAC能夠對天然CPA起到一定的免疫保護作用[11-15]。然而,由于CPAC蛋白分子量較小,研究者通常選擇將CPAC與GST等大分子量標簽蛋白融合表達,從而引入了無關的抗原成分。為了更好發揮CPAC對天然CPA的抗原保護作用,本研究根據現行A型產氣莢膜梭菌標準株(C57-1株)CPAC的編碼序列,按大腸桿菌偏愛的密碼子進行優化設計,并將CPAC進行二次重復,經原核系統表達、純化和鑒定,并對重組蛋白的免疫保護性進行研究。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒、實驗動物和試劑 A型產氣莢膜梭菌C57-1株、C57-1株天然毒素、C57-1毒素抗血清及pET-30a(+)(以下簡稱pET)均為本實驗室保存；1.5～2.0 kg普通級健康日本大耳白兔和體重16～18 g ICR小鼠,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；感受態細胞,購自北京全式金生物科技有限公司；佐劑Montanide ISA 201,購自法國Seepic公司；蛋白 Marker(M1)、Western Blot Marker(M2)、Ni-IDA親和層析介質試劑盒,購自金斯瑞生物科技有限公司；高保真PCR酶KOD,購自東洋坊；Premix taq version 2.0,購自 TaKaRa公司。T4 DNA連接酶、DNA凝膠回收試劑盒,購自Promaga公司；限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ,購自NEB公司；抗His標簽單抗、Bradford蛋白濃度測定試劑盒,購自碧云天生物技術有限公司。

1.2 基因合成及密碼子優化 以C57-1的CPAC(GenBank號：AY823400.1)基因為模版,按大腸桿菌偏愛密碼子進行優化設計并二次重復,片段之間用氨基酸GGGS連接。同時,在基因C末端添加6×His標簽蛋白的編碼區,人工合成GCPAC2。

1.3 原核表達載體的構建 以GCPAC2為模板,采用引物對1F/1R進行PCR擴增。其中上游引物1F序列為：5′-GGCGGATCCGTTGGTAAGAAC-3′,其 5′端引入限制性內切酶BamHⅠ位點(下劃線部分)；下游引物1R序列為：5′-GGCCTCGAGTTAGTGGTGATGGT,其5′端引入限制性內切酶XhoⅠ位點(下劃線部分)。PCR體系為50 μL,反應條件為：94℃預變性4 min；98℃變性10 s,56℃退火30 s,68℃延伸90 s,共33個循環；最后68℃延伸7 min。

回收DNA條帶,采用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后,與pET連接。將連接好的質粒轉化Top10感受態細胞,挑取單克隆,37℃振蕩培養過夜后,提取質粒。對所提質粒進行PCR鑒定后送測序,將測序正確的質粒命名為pCPAC2。

1.4 重組蛋白的表達與純化 將pCPAC2以及pET轉化至BL21感受態細胞中,分別在15℃和37℃條件下用IPTG誘導表達,并檢測重組蛋白的表達情況及其可溶性以及與以抗His抗體的反應性。包涵體采用洗滌液洗滌后,以緩沖液溶解。平衡Ni-IDA柱后,與可溶蛋白孵育,最后用不同濃度咪唑的平衡緩沖液洗脫目標蛋白,并收集每個洗脫組分檢測。收集純度較高的洗液,用透析袋進行透析和復性后,上清用0.22μm濾器過濾分裝,最終得到重組蛋白rCPAC2。最后測定蛋白濃度后保存于-80℃備用。

1.5 rCPAC2與A型產氣莢膜梭菌毒素抗血清的反應 以A型產氣莢膜梭菌毒素抗血清為一抗,HRP標記的山羊抗兔IgG二抗,檢測rCPAC2與A型產氣莢膜梭菌毒素抗血清的反應。

1.6 抗原性分析

1.6.1 免疫程序 將rCPAC2與Montanide ISA 201佐劑以1∶1(v/v)的比例配制成終濃度為50 μg/mL的疫苗,另取滅菌PBS與Montanide ISA 201佐劑以1∶1(v/v)的比例制備對照疫苗,置4℃保存備用。選用體重1.5～2.0 kg健康家兔,取8只對A型產氣莢膜梭菌毒素的中和效價為0的家兔,其中4只頸部皮下注射疫苗,2.0 mL/只,免疫后14 d,以相同劑量、相同途徑進行二免。另外4只以免疫對照疫苗。

1.6.2 血清中和效價測定 分別在一免后14 d以及二免后21 d,對試驗組及對照組所有家兔經耳緣靜脈采血,分離血清備用。按照《中華人民共和國獸藥典》(2015年版)三部中規定的方法測定血清中和效價[16]。

1.6.3 攻毒試驗 二免后21 d,通過耳緣靜脈各注射1個家兔MLD劑量的A型產氣莢膜梭菌毒素,觀察5 d,記錄家兔的死亡情況,判定試驗疫苗的免疫保護效力。

2 結果

2.1 CPAC2串聯基因的原核表達載體的成功構建獲得的重組質粒酶切后出現大小約5 kb的載體DNA片段,以及大小約765 bp的基因片段,與預期相符。測序結果表明,插入的外源基因序列正確,將此質粒命名為pCPAC2。

2.2 CPAC2串聯基因的原核表達與純化 將pCPAC2以及pET轉化BL21并誘導表達。結果顯示,在15℃誘導16 h和37℃誘導4 h兩種條件下重組蛋白的表達形式均以包涵體為主,且能與抗His抗體發生反應,分子量約為40 kDa,大小與預期相符(圖1)。綜合考慮蛋白表達量和誘導時間,選擇37℃誘導4 h的誘導條件。如圖2所示,收集純度較高的Lane7～9洗脫液進行透析和復性,最終獲得了的蛋白rCPAC2濃度為0.771 mg/mL。

圖1 rCPAC2的原核表達與鑒定

圖2 rCPAC2的純化

2.3 rCPAC2與A型產氣莢膜梭菌毒素抗血清的鑒定 結果如圖3所示,rCPAC2與A型產氣莢膜梭菌毒素抗血清發生反應。

2.4 rCPAC2的免疫原性分析

2.4.1 抗rCPAC2兔血清的毒素中和抗體效價測定經血清中和法測定,以rCPAC2免疫兔子后,每毫升的一免和二免抗血清分別可中和30個小鼠和80個小鼠MLD的A型產氣莢膜梭菌梭菌毒素。

圖3 rCPAC2與A型產氣莢膜梭菌抗毒素血清的反應

2.4.2 rCPAC2免疫對兔的免疫保護結果 在第2次免疫后21 d,耳緣靜脈注射1 MLD劑量的A型產氣莢膜梭菌天然毒素進行攻毒,結果發現,對照的家兔在5 d內全部死亡,rCPAC2免疫組的家兔在5 d內全部鍵活。

3 討論

隨著研究的深入,與產氣莢膜梭菌密切相關的主要致死性外毒素的結構和致病機理越來越清晰,致死性外毒素的部分無毒區域(CPA[11-13]、CPB以及CPI的C末端[17])或者無毒突變體(ETX)[18]和θ毒素(PFO)[19]作為亞單位疫苗抗原已經被證實能夠有效地中和相應的毒血癥。作為A型產氣莢膜梭菌的主要致死性毒素,CPA的減毒乃至無毒研究工作成為了眾多研究者的方向。雖然對CPA發揮功能的關鍵氨基酸位點進行單點突變能夠實現減毒的目的[20],但這些突變體的免疫原性還沒有得到充分的研究。此外,單個氨基酸突變的CPA在未來基因工程疫苗大規模生產中存在一定的生物安全隱患。已有研究表明,CPA分子主要由CPAN和CPAC構成。其中,具有細胞毒性的CPAN是CPA酶活性的中心,而無細胞毒性的CPAC主要發揮著與細胞受體相結合的功能。對CPA的兩個區域免疫保護性分析的結果表明,單獨的CPAC具有一定的免疫保護作用,而單獨的CPAN卻無免疫保護作用。然而,由于單獨的CPAC分子量過小,需要與GST等標簽蛋白串聯表達,從而造成CPAC實際的抗原量不足,而且對難以對該蛋白的免疫保護性進行準確定量。為此,本研究將CPAC進行2次重復后進行串聯表達,不僅增加了有效抗原量,也增加抗原蛋白整體的分子量,更有利于增強分子的抗原性。

本研究發現在15℃的條件下誘導16 h后,rCPAC2可溶性表達比例可達15%,明顯高于37℃條件下。但綜合考慮蛋白表達量和誘導時間,我們選擇選擇37℃誘導4 h。試驗結果證明以非可溶形式表達的rCPAC2經純化復性后具有較好的免疫原性。在實際生產中,以包涵體形式表達的重組蛋白在純化中可顯著產物中內毒素的含量。然而,在前期的研究中我們發現可溶性重組ETX免疫原性明顯高于非可溶性的重組蛋白。為此,探討如何提高rCPAC2的可溶性表達及其免疫原具有重要意義。