山羊 IL-1 β IL-8和 Mx1因子實時熒光定量檢測方法的建立

孫文超,易馳喆,汪 偉,曹 亮,張世亨,閉璟珊,韋顯凱,辛佳亮,李文杰,張克龍,鄭 敏,魯會軍,張紅云,蘇姣秀

(1.溫州大學病毒學研究所,浙江 溫州 3250352；2.軍事科學院軍事獸醫研究所,吉林 長春 130122；3.廣西動物疫病預防控制中心,廣西 南寧 530001；4.廣西大學動物科技學院,廣西 南寧 530004)

山羊和綿羊痘病毒屬于痘病毒科,山羊痘屬,該病毒粒子大小為橢圓形,為含囊膜的雙鏈DNA病毒。山羊和綿羊痘病毒是主要感染山羊和綿羊這兩種物種,未見野生偶蹄類動物感染病例。山羊和綿羊痘在非洲和亞洲的部分地區、中東以及印度次大陸的大部分地區都有發現。孟加拉國每年都會暴發山羊和綿羊痘,導致嚴重經濟損失。該疫情主要見于冬末和秋末(當年10月份至次年4月份)。病毒經常在緊密接觸時通過呼吸道傳播,也可通過其他黏膜或磨損皮膚感染。病毒在唾液、鼻腔和結膜分泌物、乳汁、尿液和糞便以及皮膚損傷和結痂中經常檢測到。黏膜上的潰瘍是病毒擴散的重要來源。

使用減毒或滅活疫苗可能有助于預防和控制山羊和綿羊痘。然而目前關于羊痘病毒引起的相關炎性細胞因子和抗病毒因子的研究相對較少,本研究建立羊炎性因子(IL-1β和IL-8)和Mx1因子實時熒光定量檢測方法,為山羊痘感染后的羊炎性和抗病毒因子在mRNA水平研究提供有力的技術支持。

1 材料與方法

1.1 試劑 外周血單核細胞分離液試劑盒,購自北京索萊寶科技有限公司；總RNA抽提試劑盒,購自生工生物工程(上海)股份有限公司；2×Taq PCR Master Mix,購自天根生化科技(北京)有限公司；質粒小量提取試劑盒,購自杭州愛思進生命科學有限公司；ConA,購自碧云天生物科技研究所；MLV Reverse Transcriptase、SYBR Green Real-time PCR Master Mix,均購自Promega公司。

1.2 毒株、菌株和載體 山羊痘AV41株由廣西壯族自治區疫控中心保存；感受態細胞DH5α,購自天根生化科技(北京)有限公司；pMD18-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 儀器 Nanodrop 2000分光光度計、ABI Prismr 7500型熒光定量 PCR儀,均購自賽默飛Thremo公司。

1.4 方法

1.4.1 引物的設計與合成 根據GenBank中羊IL-1β、IL-8和Mx1因子基因序列,利用引物設計軟件PrimerExpress和Oligo7分別設計相應的引物序列(見表1),以上引物均由寶生物工程(大連)有限公司合成。

表1 Real-time PCR引物

1.4.2 cDNA樣品的制備 無菌采集健康山羊抗凝血20 mL,分離外周血單核細胞。同時用Con A和PHA刺激12 h后加入TRIZol收集樣品提取總RNA,將樣品反轉錄后所得 cDNA置于 -20℃備用。

1.4.3 基因克隆 以制備的cDNA樣品為模板進行IL-1β、IL-8和Mx1細胞因子PCR擴增,PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定,膠回收純化后連接到pMD-18T載體。將連接產物轉化DH5α,LB平板上培養12 h,挑取單菌落,37℃恒溫搖床上培養12 h后小量提取質粒,酶切鑒定正確后進行測序鑒定,將陽性質粒作為標準質粒。

1.4.4 標準品的制備 標準質粒樣品使用Nanodrop 2000分光光度計分別測量濃度,根據換算公式計算各樣品中重組質粒的拷貝數。IL-1β、IL-8和Mx1拷貝數分別是4.7×1010Copies/μL、9.32×109Copies/μL、9.97 ×109Copies/μL。 然后對標準品分別進行10倍梯度稀釋,取不同稀釋度的標準品作為模板。

1.4.5 標準曲線的建立 以稀釋好的標準品為模板,對引物濃度和退火溫度進行優化,篩選出最佳反應條件。隨后以不同稀釋梯度的標準品為模板,進行正式試驗,Real-time PCR用SYBR GreenⅠ染料法進行測定。反應體系20 μL：SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL；上游/下游引物各1 μL；模板1 μL；蒸餾水7 μL。系統將自動生成標準曲線、相關系數、擴增效率以及熔解曲線。

1.4.6 靈敏度試驗以及重復性試驗 將標準質粒做10倍梯度稀釋,共稀釋12個梯度。用稀釋的樣品模板(同時設置陰性對照)進行Real-time PCR反應,每個樣品設置3個重復,檢驗該方法能檢測到的最低拷貝數。同時以標準質粒為對照計算組間及組內的變異系數,分析試驗的重復性。

1.4.7 山羊外周血淋巴細胞因子mRNA的實時定量PCR檢測 利用本試驗利用羊痘病毒AV41株和Con A分別刺激山羊外周血淋巴細胞因子,通過對IL-1β、IL-8和 Mx1細胞因子 mRNA水平進行檢測。

2 結果

2.1 羊細胞因子基因片段的擴增及重組質粒標準品的制備 利用山羊外周血提取cDNA為模板基因組為模板,以IL-1β、IL-8和Mx1引物進行PCR擴增IL1β、IL-8和Mx1基因。結果顯示,各自的目的片段與預期大小一致(圖1)。重組質粒測序結果顯示,成功構建羊IL-1β、IL-8和Mx1細胞因子標準品。

圖1 細胞因子的PCR鑒定結果

2.2 標準曲線的建立及熔解曲線分析 最終確定優化的反應體系如下：10 pmol/L上、下游引物各1 μL、2×SYBR Green Real-time PCR Master Mix 10 μL、模板1 μL,去離子水補至20 μL。 羊 IL-1β、IL-8 和 Mx1細胞因子重組質粒進行10倍梯度系列稀釋,分別選取不同濃度的質粒進行熒光定量PCR擴增,同時每個稀釋度做兩個重復試驗。結果表明羊IL-1β、IL-8和Mx1細胞因子標準曲線Ct值和標準質粒濃度間呈現良好的線性關系,R2均大于0.990(圖2)。

2.3 特異性檢測結果 用建立的SYBR Green I熒光定量PCR進行擴增反應,結果顯示未出現特異性擴增,只有1個特異性峰Tm值介于82.5℃～85.5℃之間,無引物二聚體及非特異性擴增產物出現。

2.4 敏感性檢測結果 以10倍系列稀釋的質粒DNA為模板,對標準品進行SYBR Green I熒光定量PCR。結果顯示,IL-1β、IL-8和Mx1細胞因子檢測體系檢出下限分別為4.7×103Copies/μL、9.32×103Copies/μL、9.97 ×101Copies/μL。

2.5 重復性檢測結果 將不同稀釋度羊IL-1β、IL-8和Mx1細胞因子標準品質粒進行SYBR Green I熒光定量PCR,用統計學軟件分析結果,表明建立的SYBR Green I熒光定量PCR方法組間變異系數為0.664% ～1.09%,組內變異系數為0.77% ～1.56%,組內和組間變異系數均在2%以內表明重復性和穩定性好。

圖2 IL-1β、IL-8和Mx1細胞因子Real-time PCR標準曲線

表2 羊IL-1β、IL-8和Mx1細胞因子熒光定量PCR檢測重復性試驗

2.6 山羊外周血淋巴細胞因子mRNA的實時定量PCR檢測結果 本試驗利用羊痘病毒AV41株和Con A分別刺激山羊外周血淋巴細胞,通過對IL-1β、IL-8和Mx1細胞因子mRNA熒光定量檢測。試驗結果表明,山羊外周血淋巴細胞中羊炎癥因子IL-1β和IL-8 mRNA表達水平與Con A對照組相比均有明顯差異,羊痘感染可以促進機體產生大量的炎癥因子。羊痘感染組Mx1細胞因子明顯低于Con A對照組,表明羊痘病毒在復制過程中可能抑制了機體的先天免疫應答(圖3)。

圖3 山羊外周血淋巴細胞因子mRNA表達分析

3 討論

I型干擾素(IFN)是天然免疫反應的重要介質,對于限制病毒的早期復制和傳播至關重要。I型IFN的重要下游效應因子是黏病毒抗性基因(小鼠和豬Mx1、人MxA)[1]。Mx基因幾乎存在于從魚類到靈長類動物的所有脊椎動物的基因組[2]。不同物種的Mx蛋白具有不同的抗病毒活性,并且Mx蛋白的亞細胞定位有助于抗病毒作用[3]。IFN-α/β、雙鏈RNA或病毒感染能夠誘導Mx1的高水平表達[4]。Mx1蛋白可以在體內外抑制多種病毒的生長,包括正黏病毒、布尼亞病毒、彈狀病毒、副黏病毒和漢坦病毒[5]。研究表明,Mx1/MxA蛋白通過直接抑制病毒基因組的復制來發揮其抗病毒作用,因此Mx1具有廣譜的抗病毒活性。炎癥反應在病毒感染過程中起到至關重要的作用。白細胞介素IL-1β(Interleukin-1β,IL-1β)是主要的炎性細胞因子之一[6],IL-1β在炎癥反應中是通過上調炎癥基因基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)介導[7]。MMPs主要降解細胞外基質組分。基質金屬蛋白酶在生理和病理過程中均參與ECM的重塑,包括器官產生/再生、血管生成、傷口愈合、炎癥和腫瘤生長都是非常重要的[8]。此外,MMP-9涉及多種病理狀況,如研究發現,這種高表達促炎性細胞因子血癥對流感病毒感染的宿主防御反應。然而,高水平的促炎性細胞因子的存在會損害線粒體的能量代謝,導致細胞功能障礙和器官衰竭。白細胞介素-8(Interleukin-8,IL-8),又稱為趨化因子8(CXCL8)[9]。早期研究發現,IL-8是內皮細胞的趨化和生長因子,后來研究發現IL-8的受體CXCR1和CXCR2結合從而使中性粒細胞趨化到反應部位,實現機體局部的炎癥反應[10]。CXCR1和CXCR2受體也在各種腫瘤細胞廣泛表達可以高親和力結合IL-8[11]。

實時PCR熒光標記技術與傳統的PCR相比敏感度高、省時、方便。該技術已經應用在流感病毒A和B、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等的檢測和鑒別。本研究建立羊IL-1β、IL-8和Mx1細胞因子的Real-time PCR檢測方法,Tm值介于82.5℃～85.5℃之間；重復性良好,組內和組間變異系數均小于2%；IL-1β、IL-8和Mx1細胞因子檢測體系檢出下限分別為 4.7×103Copies/μL、9.32×103Copies/μL、9.97 × 101Copies/μL。 山羊炎癥因子IL-1β、IL-8 mRNA水平均顯著高于 ConA對照組,證實羊痘感染可以刺激機體產生大量的炎癥因子。而羊Mx1細胞因子與Con A對照組相比均有明顯較低,可能羊痘病毒在復制過程存在抑制機體免疫系統的抗病毒作用。例如羊痘病毒編碼的N1蛋白同時具有抑制宿主細胞凋亡信號通路的能力。然而目前關于羊痘病毒的分子機制還不是很清楚。本研究利用熒光定量方法檢測羊痘病毒IL-1β、IL-8和Mx1細胞因子mRNA表達水平,為研究山羊痘感染后分子免疫機制的提供了可靠的技術支撐。