參麥微球及其在Wnt信號通路下對骨髓間質干細胞分化為神經元細胞的誘導作用▲

李志彬 郭玉海 邢慶嘉 劉權鋒

(廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣東省廣州市 510000，電子郵箱：1529025610@qq.com)

脊髓損傷是脊柱損傷最嚴重的并發癥，常可導致損傷節段以下肢體嚴重的功能障礙，這不僅給患者的身體和心理造成嚴重傷害，還給整個社會增加巨大的經濟負擔。脊髓損傷的預防、治療和康復已成為當今醫學界的研究重點之一。骨髓間質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)是一種普遍存在于骨髓中的非造血干細胞，具有向脂肪細胞、心肌細胞、骨細胞、軟骨細胞及神經細胞等分化潛能[1-4]。此外，BMSC可在體外存活并且迅速增殖[5]，最重要的是其具有免疫原性低、免疫耐性強，可異體移植等優點[6]。BMSC向神經元細胞分化是目前的研究熱點之一[7]。曾有學者將BMSC移植到脊髓損傷的動物體內，發現只有少數BMSC能夠向神經元細胞分化，雖然實驗動物的脊髓功能在一定程度上可以恢復，但療效并不滿意[8]。因此，本研究在Wnt信號通路下，利用中藥微球誘導BMSC向神經元細胞分化，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與設備 (1)標本及試劑：成人骨髓來源于5名成年自愿者的無器質性病變的肋骨。胎牛血清購自美國HyClone公司(批號：SH30087.01)，無血清改良伊格爾培養基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM)-高糖培養基、青/鏈霉素、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)均購自美國HyClone公司(批號：SH30022.01B、SH30010、SH30256.01B)，反轉錄試劑盒及PCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司(批號：RR047A、HRR820A)。Anti-CD11a抗體[異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocynate,FITC)]、Anti-CD14抗體[藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)/Cy5.5?]、Anti-CD29抗體均購自Abcam公司(批號：ab27387、ab25390、ab78502)。Wnt3a、Wnt5a均購自R&D公司(批號：5036-WN、645-WN)。一抗包括抗神經絲蛋白-M(neurofilament-M，NF-M)抗體、抗神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)抗體、抗巢蛋白抗體、抗微管聯合蛋白(microtubule-associated protein,MAP)-2抗體、抗生長相關蛋白(growth-associated protein,GAP)-43抗體(EP890Y)、抗膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體均購自Abcam公司(批號：ab24574、ab53025、ab6320、ab5392、ab75810、ab7260)；二抗包括兔抗人IgG H&L(辣根過氧化物酶)和山羊抗人IgG H&L(辣根過氧化物酶) 均購自Abcam公司(批號：ab6759、ab6858)。(2)設備：MSH-R-20型磁力攪拌器購自KEWLAB公司，SW-CJ-IF(D)型潔凈工作臺購自蘇州安泰科技有限公司，TDL-80-2B型低速離心機購自蘇州安泰科技有限公司，BDS200型倒置光學顯微鏡購自蘇州安泰科技有限公司,HERAcell 150i型細胞恒溫培養箱購自賽默飛世爾科技公司，K2800微量分光光度計購自北京凱奧公司，Accuri C6流式細胞儀購自BD公司。(3)藥品：中藥微球與空白微球供試品由廣東藥學院研制(批號：20140317b)。海藻鹽購自美國FMC公司(批號：131004)，10%參麥液購自正大青春寶藥藥業有限公司(國藥準字:Z33020021)，殼聚糖購自齊云生物科技有限公司(批號：2011107)，成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)購自R&D公司(批號：233-FB)。

1.2 BMSC的分離培養及其鑒定

1.2.1 分離培養：無菌條件下，用50 mL含0.01%肝素的PBS稀釋骨髓液，充分混勻后轉入離心管，1 500 r/min、20℃離心20 min，棄上清及脂肪層，用DMEM充分混勻后沉淀；取20 mL稀釋液輕輕疊加到20 mL Ficoll淋巴細胞分離液(密度為1.077×103g/L)上，2 000 r/min、20℃離心30 min，收集單核細胞層；用無血清DMEM洗滌兩次，分別1 500 r/min離心10 min后按1×105個細胞/cm2接種于25 cm2培養瓶內，置于0.5% CO2的培養箱37℃下培養；3 d后半量更換培養液，2～3 d等量換液1次。

1.2.2 傳代培養：分離培養10 d貼壁細胞接近融合后進行傳代培養。無菌操作下打開細胞培養瓶瓶蓋，棄舊培養液，用PBS洗滌細胞1～2次，加入1 mL胰酶細胞消化液溶液，輕洗細胞皿底部。吸掉消化液，放入37℃培養箱2～3 min，輕拍培養瓶壁使大部分細胞脫落，于倒置顯微鏡下觀察，當細胞將要分離而呈現圓粒狀時，加入適量含血清的新鮮DMEM以終止胰蛋白酶的作用，吸管上下吸放數次以打散細胞團塊，混勻后，補足3n mL(n為傳代瓶數)DMEM，依稀釋比例轉移至新的培養瓶中，放入細胞培養箱，于5% CO2、飽和濕度、37℃下培養。

1.2.3 鑒定：取第3代培養細胞，分成3管，每管細胞濃度為1×107個細胞/100 μL，其中A管作為空白對照，B管用于CD29-PE和CD11a-FITC檢測，C管用于CD14-FITC和CD29-PE雙標記檢測。A管中不加抗體，加100 μL固定液，于室溫避光孵育20 min；B管和C管分別加入相應抗體各5 μL后，室溫避光孵育20 min。各管加入500 μL PBS洗滌1次，1 200 r/min離心5 min，棄上清，加0.2 mL PBS重懸細胞后，使用流式細胞儀分別檢測CD14-FITC、CD11a-FITC和CD29-PE的熒光強度，以分析CD11a、CD14和CD29的表達情況。

1.3 中藥微球定向誘導后的神經元樣細胞鑒定

1.3.1 微球的制作：(1)中藥微球：把含有3%(v/v)司盤-80的液體石蠟用磁力攪拌器以900 r/min攪拌10 min后，添加3%海藻酸鈉液2 mL及10%參麥液1 mL的混合液，繼續以900 r/min攪拌10 min，隨后加入2 mL 3%殼聚糖(溶解于去離子水中)以900 r/min攪拌10 min，再緩慢加入3 mL的3%氯化鈣(溶解于去離子水中)以確保高效交聯。分別使用松節油、95%酒精和蒸餾水以6 000 r/min各自離心15 min。提取微球，室溫下風干。(2)空白微球：同樣將含有3%(v/v)司盤-80的液體石蠟以900 r/min攪拌10 min后，單純添加3%海藻酸鈉2 mL繼續以900 r/min攪拌10 min，余步驟與中藥微球相同。

1.3.2 中藥微球誘導BMSC：將無菌的中藥微球與空白微球分別用低糖DMEM完全培養基浸泡3 d。選取第3代的BMSC分為空白組和誘導組。兩組BMSC均以2×105個細胞/mL接種到預先置有蓋玻片的6孔板中制備細胞爬片，待細胞達80%融合時，棄培養基，加入含10 μg/L bFGF的DMEM完全培養基預誘導24 h，PBS洗滌3次，空白組加入含空白微球的無血清DMEM培養基，誘導組加入含中藥微球的無血清DMEM培養基，空白微球和中藥微球在培養基的終濃度均為1 mg/100 mL。兩組均誘導3 h，每隔15 min于倒置顯微鏡觀察細胞形態的變化。

1.3.3 免疫組織化學法鑒定神經元樣細胞：誘導3 h后，采用免疫組織化學鏈霉親和素-生物素化過氧化物酶復合物法檢測空白組和誘導組NF-M、NSE、巢蛋白、MAP-2、GAP-43、GFAP的表達。PBS漂洗誘導后的細胞2次(2 min/次)后，4%多聚甲醛室溫下固定20 min；0.5%聚乙二醇辛基苯基醚(Sigma公司，T9284)室溫下處理20 min；3% H2O2室溫下處理15 min。以上每一步驟結束時均采用PBS漂洗3次(2 min/次)。加入試劑盒中的血清封閉液，37℃孵育20 min后甩干封閉液，加入相應的一抗(1 ∶200；陰性對照用PBS代替一抗)，37℃孵育1～2 h或4℃過夜；PBS漂洗，2 min/次，共3次，加入試劑盒中的二抗，37℃孵育20 min；PBS漂洗，2 min/次，共3次，放入SABC濕盒內37℃孵育20 min；PBS漂洗，4 min/次，共3次，DAB顯色2～10 min，自來水沖洗；蘇木素復染15～30 s，自來水沖洗，封片劑封片，實驗重復3次。使用Image-Pro Plus 6.0軟件(美國Media Cybernetics公司)計算各蛋白的平均吸光度(A值)；對于NSE和MAP-2的蛋白含量表達，計算陽性率，陽性率(%)=陽性細胞數/總細胞數×100%，陽性細胞通過Image-Pro Plus 6.0軟件用肉眼觀察進行計數，細胞胞體及部分突出DAB染色為棕黃色即為陽性細胞。

1.4 Wnt3a和Wnt5a誘導后巢蛋白、NSE和GFAP mRNA的表達情況 將第3代BMSC細胞以2×105個/mL接種于6孔板中，設Wnt3a、Wnt5a組及對照組。Wnt3a組和Wnt5a組分別采用誘導液1(DMEM、100 μg/mL bFGF、50 μg/L Wnt3a、參麥液微球)和誘導液2(DMEM、100 μg/mL bFGF、50 μg/L Wnt5a、參麥液微球)進行誘導，對照組不加Wnt分子而單純采用誘導劑(DMEM、100 μg/mL bFGF、參麥液微球)培養基培養。培養2周后收集細胞，采用PCR檢測巢蛋白、NSE和GFAP mRNA的表達情況。PCR步驟：(1)總RNA的提取：使用TRIzol試劑盒提取已成功誘導的BMSC的總RNA,在微量分光光度計測定RNA的濃度及質量。(2)cDNA的合成:取2 μg總RNA，使用反轉錄試劑盒,采用兩步法獲取cDNA備用，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。(3)PCR反應：參考PCR試劑盒說明書方法進行操作,以同一cDNA為模板,在20 μL反應體系內擴增，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內參，引物序列見表1。反應體系：cDNA(稀釋3倍)5.0 μL；上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL；SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL；dH2O 4.0 μL。反應條件：95℃預變性30 s，95℃ 3 s，60℃ 34 s，循環45次，實驗重復4次。最后使用ViiA7軟件分析數據，以2-△△Ct計算目的基因mRNA的相對表達量。

表1 引物序列

1.5 統計學分析 應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析或t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 BMSC的分離培養及鑒定 光鏡下可見第3代BMSC呈長梭或長的多角形，有較多的突出，見圖1。流式細胞術結果顯示，CD11a和CD14標記物均為陰性(陽性率分別為0.465%、0)，CD29標記物為陽性(陽性率為98.7%)，分離培養的BMSC純度達到98%以上，可以用于后續的實驗。

圖1 光鏡下分離培養的BMSC(×250)

2.2 微球定向誘導分化神經元細胞的鑒定結果 誘導組NF-M、巢蛋白、GAP-43的平均A值以及NSE、MAP-2陽性率均高于空白組(均P<0.05)，而兩組的GFAP平均A值差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3 Wnt3a和Wnt5a誘導后巢蛋白、NSE和GFAP mRNA的表達情況 3組細胞巢蛋白mRNA差異無統計學意義(P>0.05)；Wnt3a組的NSE和GFAP mRNA相對表達水平均高于其他兩組(均P<0.05)，而Wnt5a組與對照組間差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表3。

表2 兩組細胞免疫組化檢測指標比較(x±s)

表3 3組細胞巢蛋白、NSE和GFAP mRNA的相對表達水平比較(x±s)

注：與對照組相比，*P<0.05；與Wnt5a組相比，#P<0.05。

3 討 論

BMSC是一種多分化型干細胞。2000年Woodbury首次報告可以將BMSC誘導分化成神經元細胞等[1]，此后相關實驗室都在開展如何將BMSC向神經元細胞方向誘導的研究。在目前大部分實驗中，各研究者都是以BMSC貼壁培養作為主要的研究方向[9]，但是隨著體外培養時間的延長，BMSC向神經元細胞分化的能力有所下降，細胞凋亡率高。

參麥注射液主要是由人參和麥冬等量組成，起源于《癥因脈治》的參麥飲。現普遍認為參麥注射液具有益氣養陰、生津止渴、斂陰固脫的功效，而國內多項研究均表明，益氣養陰溫陽中藥具有抑制細胞凋亡，改善能量代謝的功能[10-11]，因此推測其可以有效改善BMSC體外凋亡率高的問題。因此我們以參麥液提取物制作中藥緩釋微球，其平均粒度為4.226 μm，粒徑呈正態分布，載藥穩定，平均載藥量為2.12%，含量相對穩定、釋放度基本不變，可有效控制藥物釋藥濃度。

CD29是介導干細胞與細胞外基質黏附的最主要分子，被認為是BMSC的重要標志物[12]，而CD11a、CD14為造血干細胞特異標記[13]。本研究將BMSC進行分離與傳代培養，所分離培養的細胞廣泛表達CD29，不表達CD11a和CD14，說明本實驗所分離培養的細胞不屬于造血系細胞，而是BMSC。我們選用第3代BMSC，用含空白微球及中藥微球的無血清培養基分別進行誘導，然后檢測NF-M、NSE、巢蛋白、MAP-2、GAP-43、GFAP的表達。其中巢蛋白是神經干細胞的特殊標記，NSE是神經細胞的特定標記，而GFAP是膠質細胞的特異性標記,NF-M是構成神經細胞軸突中間絲的蛋白質,GAP-43是一種與細胞及組織整體發育有關的蛋白之一,廣泛存在于神經元細胞。結果顯示，誘導組NF-M、巢蛋白、GAP-43的平均A值以及NSE、MAP-2陽性率均高于空白組(均P<0.05)，提示參麥微球復合BMSC后可以誘導BMSC向神經元細胞分化。

Wnt基因是由果蠅無翅基因Wingless和小鼠乳腺癌中的Int-1基因合并起來命名的，其特征為含有22～24 個保守型半胱氨酸殘基，現已在人類基因組中發現有19種Wnt基因，Wnt通路分為經典和非經典兩種，其中Wnt3a參與經典途徑[14]。經典的Wnt途徑又稱 Wnt/β-連環蛋白信號通路，由Wnt蛋白、跨膜受體、胞質蛋白、核內轉錄因子、下游靶基因等組成[15]。在Wnt信號下，Wnt激活其跨膜受體，并激活胞漿中的散亂蛋白，活化的散亂蛋白成為糖原合成激酶復合物的抑制物，阻止其對β-連環蛋白的降解，游離的β-連環蛋白在胞漿中積聚，轉位到細胞核，與核內轉錄因子—淋巴增強因子/T 細胞因子協同作用，激活下游靶基因的表達。故本研究在Wnt基因信號下應用益氣養陰中藥微球誘導BMSC，然后檢測巢蛋白、NSE和GFAP mRNA的表達。結果顯示，Wnt3a組的NSE和GFAP mRNA相對表達水平均高于其他兩組(均P<0.05)，而Wnt5a組的NSE和GFAP mRNA相對表達水平與對照組比較差異均無統計學意義(均P>0.05)。這提示Wnt3a對BMSC細胞向神經元細胞分化有明顯的誘導作用，而Wnt5a并沒有此作用。

綜上所述，利用中藥參麥微球與BMSC相結合，可成功誘導BMSC向神經元細胞方向分化，Wnt3a信號通路對其有促進作用。但在人體內BMSC能否被誘導分化或自然分化為神經細胞和神經膠質細胞，則有待于進一步研究。