腎上腺素促進膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖、遷徙和侵襲及其潛在機制

翁梅琳 王 敬 杜春春 許平波 鐘 靜

(復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科-復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系 上海 200032)

人體對急性心理社會應激的自然反應包括“戰(zhàn)斗或逃跑”的反應,導致交感神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌應激激素的激活。圍術(shù)期對腫瘤患者的長期預后有重要意義,而患者在圍術(shù)期可能出現(xiàn)明顯的應激。動物實驗表明應激激素特別是兒茶酚胺類與卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤進展相關(guān)[1]。多個臨床前研究證實應激引起的兒茶酚胺釋放對腫瘤的發(fā)生有影響,包括前列腺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌等[2-4]。應激可能促進腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制[5]。兒茶酚胺可以直接作用于腫瘤組織及其微環(huán)境,通過β腎上腺素能受體(β adrenoreceptor,β-AR)轉(zhuǎn)導信號,促進癌癥的發(fā)展、血管生成和細胞凋亡[6-7]。

膠質(zhì)母細胞瘤是最常見的大腦惡性腫瘤,是星形細胞腫瘤中惡性程度最高的膠質(zhì)瘤[8]。膠質(zhì)母細胞瘤生長迅速,大多數(shù)膠質(zhì)母細胞瘤患者在患病后2年內(nèi)腫瘤即進展[9],總生存期中位數(shù)為11.2個月,手術(shù)切除是最主要的治療手段[10-11]。因此膠質(zhì)母細胞瘤患者有較大的可能性要面對圍術(shù)期應激。既往研究主要集中在去甲腎上腺素和前列腺素對膠質(zhì)母細胞瘤細胞增殖、遷徙和侵襲的影響,對其他激素的研究較少。目前未見應激激素腎上腺素對膠質(zhì)母細胞瘤進展影響的報道。因此,本研究擬通過MTT實驗、細胞劃痕實驗(wound healing assay)和transwell侵襲實驗,探討腎上腺素對膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U87MG和U251的增殖、遷徙和侵襲的影響。

資料和方法

主要試劑及細胞株腎上腺素(貨號:E4642)、普萘洛爾(貨號:40543)和transwell實驗所需的結(jié)晶紫(貨號:C0775)購自美國Sigma Aldrich公司;鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)單克隆抗體(貨號:ab38898)、鼠抗人GAPDH單克隆抗體、兔抗鼠IgG二抗均購自英國Abcam公司;Corning?膠原Ⅳ?購自美國Corning公司;RPMI-1640細胞培養(yǎng)液及新生牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自杭州四季青生物工程材料有限公司;MTT試劑盒購自德國Carl Roth GmbH & Co.;cDNA逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR采用美國Bio-Rad公司iTaq SYBR Green Supermix試劑盒;人膠質(zhì)母細胞瘤細胞U87MG和U251均購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所。

MTT法檢測細胞存活率。U251和U87MG細胞接種在24孔板底部(5×104/孔),加入含有10%FBS的RPMI-1640細胞培養(yǎng)液,培養(yǎng)24 h后,加入不含F(xiàn)BS的RPMI-1640細胞培養(yǎng)液,并用不同濃度的腎上腺素(0.1、1、10、50、100 μmol/L)處理24 h;每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)和完全培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)3 h;去除上清液,每孔加入500 μL二甲基亞砜,震蕩10 min充分溶解。另設(shè)不加入腎上腺素處理的細胞為對照組。最后,使用微孔板分光光度計測定570 nm讀數(shù)。

細胞劃痕實驗在6孔板中培養(yǎng)U251和U87MG細胞24 h。24 h后,用細胞劃痕實驗測定細胞遷徙情況。用200 μL的吸管針尖對每個孔進行劃痕。將含有細胞碎片的培養(yǎng)基吸走,用新鮮無血清培養(yǎng)基代替。分別用不同濃度的腎上腺素(0.1、1、10、50 μmol/L)對U251和U87MG細胞進行處理,并保存在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中。在0 h和24 h兩個時間點使用顯微鏡評估劃痕變化情況,沿每個劃痕標記3個隨機選擇的點,并測量細胞遷徙的水平距離。另設(shè)不加入腎上腺素處理的細胞為對照組。

細胞體外侵襲能力測定通過transwell侵襲實驗評估細胞侵襲。Corning?BioCoatTM細胞培養(yǎng)板(24孔,8 μm孔徑)包被0.53 mg/mL Corning?膠原Ⅳ?,并按照說明書在室溫下孵育1 h。將不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基100 μL加入到每孔的上室中,以使上室底部的膜水合,將U251細胞(5 ×105)懸浮于200 μL不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基中,加入到每孔的上室中。下室內(nèi)加入750 μL含5% FBS的培養(yǎng)基。U251細胞用不同濃度的腎上腺素(0.1、1、10、50 μmol/L)進行處理,并在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中保溫24 h。吸出上室內(nèi)培養(yǎng)基,用棉花棒輕輕地擦拭上室底部內(nèi)側(cè)表面,以機械方式去除上室內(nèi)側(cè)表面的細胞。遷移至膠原Ⅳ包被的上室下側(cè)面的細胞用0.1%結(jié)晶紫染色15 min,在200倍顯微鏡下,選取5個隨機視野,計數(shù)侵入細胞,用Image J計算5個視野所得細胞的平均數(shù)。另設(shè)不加入腎上腺素處理的細胞為對照組。

qRT-PCR以TRIzol-氯仿-異丙醇法提取各細胞株的總RNA,檢測含量。按照產(chǎn)品操作說明,以20 μL體系逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。熒光定量PCR的反應條件為:95 ℃、10 min預變性,95 ℃、15 s,60 ℃、1 min共40個循環(huán),以GAPDH的Ct值作為參照,以2-ΔΔCt計算mRNA倍數(shù)變化,引物序列如表1。

表1 qRT-PCR檢測使用的腎上腺素能受體和MMP-9引物Tab 1 Primers for adrenergic receptors and MMP-9 detection by qRT-PCR

β-AR:β-adrenergic receptors;MMP:Matrix metalloproteinase.

Western blot檢測在直徑6 cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)U87MG細胞株,經(jīng)0.1、1、10、50 μmol/L腎上腺素處理24 h后,收集細胞上清液和細胞,分別用含蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液裂解,提取蛋白質(zhì)并定量。取40 μL總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜后以8%脫脂奶粉在室溫下封閉 1 h,PBST洗滌3次,在1∶1 000濃度的鼠抗人MMP-9單克隆抗體及1∶5 000濃度鼠抗人GAPDH單克隆抗體中4 ℃搖床過夜,PBST洗滌3次,以1∶5 000濃度的兔抗鼠IgG二抗室溫搖床孵育1 h,顯色。以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值計算目的蛋白質(zhì)水平。

明膠酶譜法檢測MMP-9活性U87MG細胞(1×106/mL)接種于細胞培養(yǎng)皿,用不同濃度的腎上腺素處理后收集上清液,將5×上樣緩沖液(含0.32% Tris-HCL 6.4 mL,4% SDS 8 mL,16%甘油 3.2 mL,溴酚藍0.024 g,ddH2O 2.4 mL)添加到上清液中,然后將混合液進行SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE,含0.1%明膠)電泳分離;電泳后,將凝膠放入 1×酶譜復性緩沖劑(LC2670,美國Life Technology公司)中輕輕震蕩30 min;然后將凝膠在顯影緩沖液(LC2671,美國Life Technology公司)中37 ℃孵育24 h,使用考馬斯亮藍對凝膠染色。

統(tǒng)計學分析應用Sigmaplot 14.0軟件進行統(tǒng)計學分析。對照組和實驗組(不同濃度腎上腺素)間采用單因素方差分析,MMP-9、β-AR mRNA表達變化以ΔΔCt作為統(tǒng)計量進行單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

腎上腺素促進U87MG和U251細胞增殖使用qRT-PCR檢測β腎上腺素能受體在膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251和U87MG中的表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)β1、β2腎上腺素能受體mRNA在U251和U87MG中均表達,且在U251細胞中的表達較在U87MG細胞高(圖1A)。通過MTT實驗檢測腎上腺素對U251和U87MG細胞增殖能力的影響,結(jié)果表明:50 μmol/L腎上腺素使得膠質(zhì)母細胞瘤細胞U251的增殖能力較對照組顯著升高(P=0.012 1,圖1B、C)。

腎上腺素促進U87MG和U251細胞遷徙使用腎上腺素(0.1、1、10、50 μmol/L)處理膠質(zhì)母細胞瘤細胞U87MG和U25124 h后,U87MG和U251細胞的遷徙能力隨著腎上腺素濃度升高逐漸增強;當腎上腺素濃度增加到50 μmol/L時,腎上腺素處理24 h后的U87MG細胞的遷徙能力較0 h顯著升高(P=0.001 4),U251細胞的遷徙能力也較0 h顯著升高(P=0.002 2);且腎上腺素處理24 h后,U87MG和U251細胞的遷徙能力均較對照組顯著升高(P均為0.009 1,圖2)。

圖1 β-AR能受體的表達情況以及腎上腺素對U251和U87MG細胞增殖的影響
Fig 1 β-AR expression in human glioblastoma U251 and U87MG cells and the effects of epinephrine on U251 and U87MG cell proliferation

A:Representative images of U87MG following treatment with various concentrations of epinephrine for 24 h(×20);B:Distance to be migrated(mm)of U87MG;C:Representative images of U251 following treatment with various concentrations of epinephrine for 24 h(×100);D:Distance to be migrated(mm)of U251.vs.0 h within group(n= 4),(1)P<0.05;vs.control group(n=4),(2)P<0.05.

圖2 腎上腺素對U87MG和U251細胞遷徙的影響
Fig 2 Effect of epinephrine on the migration of U87MG and U251 cells

腎上腺素促進U251細胞侵襲使用腎上腺素(0.1、1、10、50 μmol/L)處理24 h后,膠質(zhì)母細胞瘤細胞U251的侵襲能力隨著腎上腺素濃度升高而增加,當腎上腺素濃度增加到50 μmol/L時,U251的遷徙能力顯著高于對照組(P=0.009 1,圖3A、B)?？梢?腎上腺素和U251細胞侵襲能力呈劑量依賴性,繪制劑量-效應曲線,曲線拐點處的腎上腺素濃度為10 μmol/L(圖3C)。

A:Representative images of U251 following treatment with various concentrations of epinephrine for 24 h(×200).B:Number of invading glioblastoma cells following treatment with different concentrations of epinephrine for 24 h.C:Dose-effect curve of epinephrine on the invasive ability of U251.vs.control group(n=4),(1)P<0.05.

圖3 腎上腺素對U251細胞侵襲能力的影響
Fig 3 Effect of epinephrine on the invasive ability of U251

β-AR阻滯劑抑制腎上腺素對U87MG和U251細胞遷徙和侵襲的促進作用根據(jù)劑量-效應曲線,使用10 μmol/L腎上腺素處理U87MG細胞24 h后,細胞的遷徙能力較0 h顯著增加(P=0.003 2),且較對照組顯著增加(P=0.016 9);但使用10 μmol/L腎上腺素和10 μmol/L β-AR阻滯劑普萘洛爾共同處理U87MG細胞24 h后,U87MG細胞的遷徙能力和對照組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,圖4A、C)。此外,使用10 μmol/L腎上腺素處理U251細胞24 h后,U251細胞的侵襲能力較對照組顯著增加(P=0.017 4),但用10 μmol/L腎上腺素和10 μmol/L β-AR阻滯劑普萘洛爾共同處理U251細胞24 h后,U251細胞的侵襲能力和對照組相比,差異也無統(tǒng)計學意義(P>0.05,圖4B、D)?？梢?β-AR阻滯劑普萘洛爾能夠抑制腎上腺素對U87MG和U251細胞遷徙和侵襲的促進作用。

腎上腺素增加MMP-9的表達和活性使用濃度為0.1、1、10、50 μmol/L的腎上腺素處理膠質(zhì)母細胞瘤細胞U87MG后,細胞中MMP-9 mRNA的表達隨腎上腺素濃度升高而增加,當腎上腺素濃度增加到1 μmol/L時,MMP-9 mRNA的表達較對照組顯著增加(P=0.018 9,圖5A);使用濃度為0.1、1、10、50 μmol/L的腎上腺素處理膠質(zhì)母細胞瘤細胞U87MG,細胞上清液中MMP-9蛋白質(zhì)水平和MMP-9活性都隨著腎上腺素濃度升高而增加(圖5B、C)。

討 論

本研究通過MTT實驗、細胞劃痕實驗和細胞體外侵襲能力測定等方法,探索了腎上腺素是否能促進膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖、遷徙和侵襲。腫瘤細胞的增殖決定了腫瘤的生長,而其遷徙和侵襲能力決定了腫瘤的轉(zhuǎn)移。MTT實驗、細胞劃痕實驗和細胞體外侵襲能力測定分別是評估腫瘤細胞增殖能力、遷徙和侵襲能力的常用方法。

有研究表明,手術(shù)相關(guān)應激會降低患者對微小殘留灶疾病(minimal residual disease,MRD)的免疫抵抗,并直接促進MRD生存和發(fā)展,兩者的綜合作用會增加癌癥復發(fā)的風險,兒茶酚胺和前列腺素可直接作用于MRD[12]。盡管手術(shù)切除原發(fā)性腫瘤后,細胞介導免疫(cell-mediated immunity,CMI)能夠限制或消除MRD,許多患者仍表現(xiàn)為癌癥復發(fā),這可能與兒茶酚胺在體內(nèi)和體外多項實驗中表現(xiàn)出抗腫瘤CMI的作用相關(guān)[1,5,12]。兒茶酚胺還被證實可能促進乳腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[3]。

A:Representative images of U87MG following treatment with mock,10 μmol/L propranolol,10 μmol/L epinephrine or 10 μmol/L epinephrine plus 10 μmol/L propranolol for 24 h(×40);B:Representative images of U251 following treatment with mock,10 μmol/L propranolol,10 μmol/L epinephrine or 10 μmol/L epinephrine plus 10 μmol/L propranolol for 24 h(×200);C:Distance to be migrated(mm)of U87MG;D:Number of invading U251 cells.E+P:Epinephrine plus propranolol.(1)vs.0 h within group(n=4),P<0.05;(2)vs.control group(n=4),P<0.05.

圖4 β-AR阻滯劑普萘洛爾抑制腎上腺素促進U87MG細胞遷徙和U251細胞侵襲的作用
Fig 4 β-AR blocker propranolol can inhibit the effect of epinephrine on the migration of U87MG and the invasion of U251

腎上腺素作為主要的兒茶酚胺類激素,其胞外受體的激活被發(fā)現(xiàn)與癌癥進展相關(guān)。AR分為α和β亞型。β-AR在促進骨髓瘤和肺癌等多種癌細胞增殖[13-14],在前列腺腫瘤組織新生血管生成中起關(guān)鍵作用[5]。而β-AR非選擇性阻斷劑普萘洛爾能抑制兒茶酚胺介導的腫瘤生長和血管生成[15]。也有研究表明β-AR能受體激動劑并不能促進U87MG細胞增殖[16]。本研究證實β-AR在膠質(zhì)母細胞瘤細胞U251和U87MG中均有表達,且腎上腺素促進膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖、遷徙和侵襲,而普萘洛爾抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞的遷徙和侵襲。腎上腺素的這種作用是否通過β-AR途徑,是否與其他受體如γ-氨基丁酸B受體(gamma-aminobutyric acid B receptors,GABABR)、α2-AR等存在相互作用,仍需進一步研究。

既往研究表明MMP-9和腫瘤進展相關(guān):靶向IL-17A和MMP-9的雙特異性抑制劑可降低乳腺癌細胞MDA-MB-231的侵襲和活動能力[17];凝血酶(thrombin)和膠質(zhì)母細胞瘤的進展相關(guān),而MAPK和PI3K信號通路激活對于凝血酶激活的作用是相反的,MMP-9具有調(diào)節(jié)以上兩種信號通路的作用[18]。MMP-9可能在膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖和侵襲中起到了非常重要的作用[18-19]。為了闡明MMP-9是否是腎上腺素促進膠質(zhì)母細胞瘤細胞U87MG、U251增殖、遷徙和侵襲的相關(guān)蛋白,本研究檢測了MMP-9 mRNA和細胞上清液中MMP-9蛋白質(zhì)水平及其活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMP-9隨著腎上腺素濃度升高表達增加且活性增強。今后將進一步探索MMP-9在腎上腺素促進膠質(zhì)母細胞瘤細胞增殖、遷徙和侵襲中的機制。

A:Effect of various concentrations of epinephrine on the mRNA expression levels of MMP-9 in U87MG cells as measured by qRT-PCR.B:Effect of various concentrations of epinephrine on the protein expression levels of MMP-9 in U87MG cells.C:The cell-free supernatants were assayed for MMP-9 activity by gelatin zymography.(1)vs.control group(n=4),P<0.05.

圖5 腎上腺素對膠質(zhì)母細胞瘤細胞U87MG中MMP-9表達和活性的影響
Fig 5 Effect of epinephrine on the expression and activity of MMP-9 in glioblastoma U87MG cells

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)腎上腺素能促進膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖、遷徙和侵襲,而阻斷β-AR能夠拮抗腎上腺素的這種效應,且MMP-9隨著腎上腺素濃度升高其表達與活性均增強。腎上腺素促進膠質(zhì)母細胞瘤細胞增殖、遷徙和侵襲的β-AR亞型及其下游信號通路將是我們下一步的研究目標。