缺血再灌注對小鼠蛻膜化子宮內膜的作用

陳西華，曹惠子，關碩，陸超，賀斌，徐祥波*

(1.國家衛生健康委科學技術研究所，北京 100081；2.北京大學第三醫院生殖醫學中心，北京 110191)

月經是女性重要的生理現象。未妊娠的情況下，子宮內膜在雌/孕激素的作用下周期性的發生剝脫，并以出血的方式排出體外。月經異常是婦科疾病常見的癥狀，包括月經不調、閉經、月經過多、痛經、產后腹痛、惡露不盡等。正常的月經周期對女性的生殖健康與生活質量具有重要意義。

早在1940年，Markee[1]就利用恒河猴對月經現象進行研究，將人子宮內膜外植體移植到恒河猴的眼前房中，觀察到月經發生前，蛻膜化子宮內膜中螺旋動脈有節律的舒張和收縮；螺旋動脈劇烈痙攣大約24 h后，子宮內膜組織崩解并伴隨出血現象。由此推測，月經是由于子宮內膜螺旋動脈收縮、內膜發生缺血再灌注，此過程造成組織呈缺血缺氧，直接導致子宮內膜細胞壞死與崩解出血。以上是月經發生的經典理論假說。但是，關于缺氧再灌注是否存在、低氧是否直接導致子宮內膜崩解等關鍵問題，近年不同研究組得出了相互矛盾的結論。1997年，Gannon等[2]利用多普勒超聲技術對人類子宮內膜在月經過程中的微血管紅細胞流速的變化進行研究，結果未檢測到月經前子宮內膜的缺血再灌注過程。2002年Zhang等[3]發現，作為低氧的重要反應因子HIF1A與HIF2A僅在少部分人圍月經期子宮內膜標本的基質細胞中存在，且發現在低氧培養條件下，與子宮內膜崩解緊密相關的金屬基質蛋白酶proMMP-1、proMMP-3和MT1-MMP的表達以及MMP-2的活性受到抑制。而在我們的前期研究中，利用低氧探針確認了小鼠月經樣模型中孕酮撤退后子宮內膜存在低氧[4]。

本研究以小鼠月經樣模型為基礎，利用血管夾持手術的方法，研究缺血再灌注與月經發生的關系。

材料和方法

一、研究對象

1.實驗動物：SPFII級雄性與雌性13周齡NIH小鼠(國家衛生健康委科學技術研究所實驗動物中心提供)。小鼠在可控的條件下給予充足的水和食物飼養，光照6：00～18：00，溫度(21±1℃)。所有的實驗步驟均獲得國家衛生健康委科學技術研究所動物倫理委員會審查批準。

2.藥品與試劑：花生油(魯花牌5S一級壓榨)、多聚甲醛(國藥集團)、組織包埋用石蠟(Leica，德國)、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑(北京中杉金橋)。

二、研究方法

1.小鼠模型的建立：將雌鼠與輸精管結扎雄鼠進行交配，次日中午12：00見栓記為0.5 d；3.5 d，在小鼠子宮腔內注射15 μl花生油，以誘導子宮內膜發生蛻膜化；5.5 d蛻膜化誘導完成[5-6](圖1)。

圖1 小鼠模型的建立方法與實驗流程示意圖

2.分組處理：模型小鼠隨機分為3組：對照組(n=8)、假手術組(n=8)與缺血再灌注組(n=10)。對照組的小鼠不作任何處理；假手術組的小鼠進行開腹手術但不進行子宮缺血再灌注手術；缺血再灌注組子宮實行缺血再灌注手術。

小鼠蛻膜化子宮缺血再灌注手術方法：小鼠腹腔開口，將右側子宮角上下兩端的主血管用止血夾夾住。血管夾持前蛻膜化的子宮呈粉紅色，血管夾持后1 min內變為暗紅色(圖2)。確定血管夾好后開始計時，30 min后小心取下止血夾。止血夾取下后，子宮在1 min之內由暗紅色恢復為最初的粉紅色。隨后，將器官復位并仔細縫合。左側子宮角不做子宮缺血再灌注手術。手術完成時間記為處理后0 h。在處理后6 h與24 h小鼠處死取材。期間觀察小鼠陰道出血情況并記錄。

3.小鼠子宮大體形態與組織形態學觀察：小鼠子宮取材后，對子宮大體進行拍照。隨后子宮立即用4%多聚甲醛固定約24 h。固定好的小鼠子宮制成常規石蠟切片，進行常規HE染色并觀察組織形態學變化。

A：缺血再灌注手術示意圖：用止血夾夾持子宮上、下兩端的主血管；B：小鼠用止血夾；C、D：血管夾持前、后小鼠子宮。黃色箭頭指示子宮圖2 小鼠蛻膜化子宮缺血再灌注手術操作

結 果

一、陰道出血觀察

缺血再灌注組手術完成時間記為處理后0 h，并適用于其他處理組。處理后0～24 h，對照組模型小鼠未觀察到陰道出血現象，假手術組絕大多數模型小鼠也未見出血；缺血再灌注組，少數小鼠(2/10)在處理后8 h時觀察到陰道出血現象，處理后12 h約一半的小鼠(6/10)出現陰道出血現象，處理后24 h大多數小鼠(8/10)觀察到了陰道出血現象(表1)。

表1 各分組中陰道出血的小鼠數量與處理后24 h子宮內膜崩解的小鼠數量統計 [n(%)]

二、小鼠子宮內膜崩解數量統計

對各分組小鼠在處理后24 h子宮內膜崩解的數量進行統計。對照組小鼠均未發生崩解出血；假手術組僅1例小鼠的子宮發生崩解出血；缺血再灌注組，絕大多數小鼠子宮內膜發生了完全崩解。該組中發生崩解的小鼠，其子宮角夾持側與未夾持側均發生了相同程度的崩解(表1)。

三、大體形態與組織形態學觀察

處理后24 h小鼠全部處死取材。此時，所有對照組與絕大部分假手術組的小鼠子宮呈淡紅色，缺血再灌注組絕大部分小鼠子宮呈暗紅色(圖3)。

將取材子宮制作常規石蠟切片并HE染色，進行組織形態學觀察。對照組與假手術組小鼠的子宮內膜完好，蛻膜化的子宮內膜基質細胞體積增大，細胞核增大，子宮腔上皮完好，未觀察到組織內大量紅細胞滲出現象。缺血再灌注組小鼠的蛻膜化細胞邊界消失，細胞核固縮，子宮腔上皮消失，組織裸露與空腔內，觀察到大量紅細胞滲出現象，此為子宮內膜崩解出血現象(圖3)。

進一步觀察分析小鼠模型缺血再灌注組，血管夾持側與未夾持側子宮形態的變化。在處理后6 h，血管未夾持側的子宮內膜完好，未觀察到明顯的血管擴張或蛻膜化子宮內膜基質細胞崩解現象。而相比之下，血管夾持側的子宮內膜在子宮系膜對側靠近子宮腔上皮下方區域，出現明顯的血管擴張現象，大量紅細胞滲出進入基質細胞。而該區域的子宮內膜基質細胞出現了早期的崩解壞死現象。到了處理后24 h，無論夾持側或未夾持側，絕大部分小鼠的子宮內膜均觀察到完全崩解的現象，崩解程度沒有顯著差異。而假手術組在處理后6 h與24 h均未觀察到明顯的紅細胞滲出現象(圖4)。

A、B：對照組；C、D：假手術組；E、F：缺血再灌注組圖3 小鼠月經樣模型處理后24 h大體形態與組織形態學觀察(HE染色 ×200)

A～F：缺血再灌注組，其中A～C示血管未夾持側，D～F示血管夾持側，A、B、D、E示缺血再灌注后6 h，C、F示缺血再灌注后24 h；G～I：假手術組，其中G、H示假手術后6 h，I示假手術后24 h圖4 小鼠模型缺血再灌注組與假手術組在處理后6 h與24 h子宮組織形態學觀察(HE染色 ×200)

討 論

月經發生的經典理論假說認為，子宮內膜螺旋動脈缺血缺氧，引發了子宮內膜的崩解[1]。但是近幾年，缺氧在月經發生中的作用存在不少爭議，不同研究組在體內、體外或在體模型的研究結果得出相反的結論[2-4，7-9]。

本研究采用了小鼠月經樣模型對缺血再灌注在月經發生中的作用進行研究。在最早的小鼠月經樣模型中，已明確月經發生需要三個不可或缺的基本要素：(1)必要的激素準備；(2)子宮內膜發生蛻膜化；(3)蛻膜化后的孕酮撤退[10-11]。本研究將蛻膜化的小鼠子宮，利用手術方法引發小鼠單側子宮角缺血再灌注，進而觀察子宮內膜發生的變化。結果顯示，在缺血再灌注后6 h，子宮腔上皮下方區域的組織形態已發生顯著變化，血管擴張、紅細胞滲出，該區域的子宮內膜已開始發生崩解出血現象；在小鼠子宮缺血再灌注24 h后，子宮內膜發生了完全的崩解出血現象。而對照組中，沒有小鼠發生子宮內膜的崩解出血，假手術組僅1只小鼠發生崩解出血現象。可以確定，缺血再灌注在沒有孕酮撤退的情況下，即可引發子宮內膜崩解。另一方面，缺血再灌注手術僅在模型小鼠的一側子宮角實施，但在處理后24 h發生崩解出血的小鼠的雙側子宮角均發生了完全的崩解，表明缺血再灌注雖然是子宮內膜崩解出血的始動因素，但并不是導致最終崩解的直接原因。僅開腹假手術也能夠在一定程度上引發子宮內膜崩解。由此推測，缺血再灌注可能啟動了某種信號，使子宮內膜在不依賴孕酮撤退的條件下誘發了子宮內膜崩解。

缺血再灌注手術和假手術，對于小鼠子宮及小鼠機體均會造成強烈的刺激，強烈的刺激下會導致機體發生應激反應。較早前研究中已知，應激反應能夠干擾子宮正常的生殖生理現象，例如閉經、不孕、子宮內膜容受性異常等，甚至引發早產或流產[12]。以往的研究結果提示，應激反應可能是造成月經失調的主要因素[13-15]。此外，某些環境因素與下丘腦閉經現象存在一定聯系[16]。較早前，對393名女性學生的研究中發現應激能夠引發經前綜合征、月經過少、閉經與月經過多[17]。因此，缺血再灌注引發的應激反應可能在子宮內膜崩解的信號通路中起重要作用。

綜上所述，本研究結果明確了缺血再灌注能夠導致子宮內膜崩解，而缺血再灌注引發的應激反應可能在月經發生中扮演了重要的角色。但其中的分子機制仍需要更多深入研究進一步闡明。