PGE2及其受體在小鼠月經模型中子宮內膜崩解期的含量與表達研究

周芳，南楠，2，陳西華，賀斌，尹德東，盧文紅，傅龍龍，2，張博男，2，郭士格，2，梁敏，2，王介東，徐祥波*

(1.國家衛生健康委科學技術研究所，北京 100081；2.北京協和醫學院研究生院，北京 100730)

經典的月經發生假說認為，在分泌晚期，前列腺素(PGs)能促使子宮內膜螺旋小動脈收縮，加速內膜缺血、壞死及血管的破裂，進而使子宮內膜崩解脫落，導致月經的發生[1-3]。Pickles[4]首次在經血中檢測到了PGs的存在，最終認為這些脂溶性物質為前列腺素E2(PGE2)和前列腺素F2α(PGF2α)。然而，有研究者認為它們是高等靈長類動物進化的“廢棄物”，對月經發生不具有始動作用[5]。小鼠月經模型為月經機制的研究提供了重要的技術平臺。本研究小組前期在小鼠月經模型的研究中，孕酮撤退前，COX抑制劑吲哚美辛和COX-2抑制劑Dup697能夠顯著抑制子宮內膜的出血和崩解[6]，而COX是PGs的限速合成酶，本研究小組前期研究為PGs在月經發生中的主導作用提供了進一步的證據[7-9]。

子宮中主要PGs之一PGE2的功能主要是和血管擴張有關[10-11]。PGE2通過與其相應的受體結合在細胞內發揮作用，其受體屬于G偶聯蛋白受體，這些受體包括前列腺素E1受體(PTGER1)、前列腺素E2受體(PTGER2)、前列腺素E3受體(PTGER3)和前列腺素E4受體(PTGER4)[12]。其中，PTGER2主要在子宮組織的腔上皮下細胞表達，有研究表明，在妊娠大鼠子宮組織中，PTGER2在著床位點的腔上皮細胞中的第1～4天沒有表達，從第5天開始，其mRNA和蛋白質的表達均升高，隨后從第7天開始表達下降[13]。在人的月經周期中，早期分泌期的PTGER1是月經期的12.2倍，中期分泌期的PTGER2是增殖期的15.1倍[12]。本研究利用小鼠月經模型，探討了月經發生子宮組織中PGE2含量及其受體PTGER2的表達變化，為揭示其在月經發生中的功能提供線索。

資料和方法

一、研究對象

實驗動物：8～10周齡C57BL6雌鼠(SPFⅡ級)。實驗經國家衛生健康委科學技術研究所動物倫理委員會批準。小鼠在可控的條件下給予充足的水和食物，光照8：00～20：00，溫度(20±1)℃。

二、研究方法

1.建立小鼠月經模型：根據前期研究建立小鼠生理性孕酮撤退月經樣模型[14]。蛻膜化49 h后，移去孕酮皮下埋置管時記為0 h。分別在0 h、8 h、12 h、16 h和24 h取材，液氮中迅速冷凍后，于-80℃長期保存。

2.PGE2蛋白質含量的ELISA檢測：取不同時間點的小鼠子宮組織，稱重，加入PBS緩沖液，手持勻漿器(Cole-Parmer，美國)將小鼠子宮組織勻漿。離心，取上清，采用ELISA試劑盒(Cayman，美國)檢測勻漿組織中PGE2蛋白質含量，分光光度讀數值(Thermal Fisher，美國)。根據標準曲線，計算出不同時間點子宮組織勻漿中PGE2的相對含量。

3.Ptger2 mRNA的實時熒光定量PCR檢測：將-80℃保存的子宮組織標本，用TRIzol(Invitrogen，美國)提取總RNA，42℃孵育3～5 min，消除基因組DNA。將總RNA與隨機引物及Oligo(dT)充分混合，25℃孵育10 min，42℃孵育50 min。85℃水浴孵育5 min后，冰上冷卻，將RNA反轉成cDNA。將各個時間點的小鼠子宮組織cDNA，用實時熒光定量PCR試劑盒(Abm，加拿大)檢測Ptger2 mRNA表達，以β-Actin作為內參，利用ΔΔCt的方法統計分析mRNA的相對表達量。所用引物見表1。

4.PTGER2蛋白免疫組織化學檢測：小鼠子宮組織用4%多聚甲醛固定24 h后，常規制備石蠟切片(Leica，德國)。將切片脫蠟并水化，用枸櫞酸緩沖液(pH6.0)95～98℃水浴孵育20 min進行抗原修復。再加入3%H2O2室溫孵育10 min，用PTGER2抗體對子宮切片進行免疫組化染色，孵育兔抗鼠PTGER2多克隆抗體(Abcam，美國)，按照二抗試劑盒(北京中杉金橋)方法孵育羊抗兔多克隆抗體，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，在顯微鏡下觀察，待顯色合適時終止。PBS中浸泡清洗后，用蘇木精復染細胞核，中性樹膠封片。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

5.PTGER2蛋白Western blot檢測：用蛋白提取試劑盒(Thermo Fisher，美國)提取小鼠子宮組織總蛋白，加入適量蛋白酶抑制劑Cocktail(Merck，美國)；取20 μl蛋白溶液進行SDC-PAGE凝膠電泳(Bio-Rad，美國)，隨后轉移至0.25 μm PVDF膜(Merck，美國)；分別進行目標蛋白PTGER2(Abcam，美國)和β-Actin(北京康為世紀生物)的蛋白免疫印跡，最后用ECL發光試劑盒(北京全式金生物)檢測其表達情況。

三、統計學方法

采用Excel表對實驗數據進行統計分析。實驗數據以(平均數±標準差)表示，多樣本均數比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩樣本之間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、小鼠月經模型子宮組織中PGE2的含量

PGE2在子宮內膜崩解脫落期即孕酮撤退0～24 h子宮組織中的含量變化顯示，PGE2在整個過程呈現逐漸升高的趨勢(圖1)。在0 h和8 h PGE2含量較低，隨著時間的推移，在孕酮撤退12 h，逐漸增加(P<0.01)，而在孕酮撤退16 h，PGE2含量達到最大值(P<0.01)；在孕酮撤退24 h，略有下降，但仍顯著高于0 h(P<0.01)。在孕酮撤退12～24 h顯著高于0 h和8 h(P<0.01)；孕酮撤退12～16 h是子宮內膜崩解脫落的關鍵期，此時PGE2含量顯著增加，提示PGE2對子宮內膜的崩解脫落起重要作用。

相互比較，*P<0.01圖1 小鼠月經模型孕酮撤退后0～24 h子宮組織PGE2蛋白表達

二、PGE2受體PTGER2蛋白在小鼠月經模型子宮內膜崩解期的定位

PTGER2蛋白在孕酮撤退的0～24 h定位于整個蛻膜化區域，且未呈現區域性的變化。在孕酮撤退的0 h，PTGER2的陽性信號較弱，主要定位于腔上皮下的基質細胞區域和整個蛻膜化區域；在孕酮撤退的8 h，陽性信號定位與0 h相似；在孕酮撤退的16 h，陽性信號明顯增強，主要定位于蛻膜化整個區域的細胞漿中，顏色呈深棕色，雖然信號強度增強，但其定位并未呈現出區域性的特征；在孕酮撤退的24 h，陽性信號較16 h有所減弱，主要定位于中間蛻膜化剝脫壞死的區域(圖2)。

三、Ptger2 mRNA與PTGER2蛋白在小鼠月經模型子宮內膜崩解期的表達

在孕酮撤退后0 h，Ptger2 mRNA表達水平相對較低；隨后在孕酮撤退后8 h和16 h，雖然此時子宮內膜崩解的程度進一步加大，但是此時Ptger2 mRNA與0 h相比，無顯著變化(P>0.05)；在孕酮撤退后24 h，Ptger2 mRNA的表達較孕酮撤退后0～16 h顯著升高(P<0.01)(圖3)。

同時，對PGE2受體PTGER2在孕酮撤退0～24 h 的蛋白質表達進行了研究。發現PTGER2蛋白質在整個子宮內膜崩解過程即孕酮撤退的0～24 h中的表達并沒有顯著變化(P>0.05)(圖4)。

A和a：孕酮撤退后0 h；B和b：孕酮撤退后8 h；C和c：孕酮撤退后16 h；D和d：孕酮撤退后24 h左排為低倍視野(×100)；右排為低倍視野中黑色方框區域的放大圖像(×400)；箭頭示典型陽性著色圖2 小鼠月經模型崩解期0～24 h的子宮組織PTGER2蛋白表達(免疫組化染色)

與其他各時間點比較,*P<0.01圖3 小鼠月經模型孕酮撤退后0～24 h子宮組織Ptger2 mRNA表達

圖4 小鼠月經模型孕酮撤退后0～24 h子宮組織PTGER2蛋白表達

討 論

本研究探索了PGE2及其受體PTGER2在小鼠月經模型子宮內膜崩解期中的含量以及蛋白表達變化。本研究首先探討PGE2在子宮內膜的崩解期即孕酮撤退的0～24 h各時間點的含量變化，發現在12～16 h時子宮內膜的崩解期顯著增加，此時是子宮內膜崩解關鍵期，提示PGE2對子宮內膜的崩解可能起重要作用。PGE2的功能主要是和血管擴張有關。有研究表明，月經經血中的PGE2水平是血清或腹膜液體中的2～3倍[15]。PGE2和PGF2α在月經周期的分泌期增殖表達均升高，甚至貫穿表達于整個月經周期[16-17]，我們的研究結果與其一致。

PTGER2作為一種刺激性G蛋白偶聯受體，PGE2誘導的PTGER2激活可激活腺苷酸環化酶，導致細胞質cAMP水平升高和蛋白激酶A的激活。PTGER2也可激活糖原合酶激酶3β和β-連環蛋白途徑[18]。PTGER2存在于牛的子宮內膜中，其伴隨著內膜中外植體生長因子的表達和細胞增殖表達而增加，預測其與子宮內膜的生長密切相關[19]。有研究表明，在子宮內膜異位癥婦女腹膜液中PGE2的含量較高，高濃度的PGE2對異位內膜的生存和生長中起著重要作用[20]。PGE2能夠促進含有PTGER2的子宮內膜癌細胞Ishikawa細胞系中HIF-1αmRNA和蛋白質的表達。COX-2抑制劑可以明顯地減小子宮蛻膜區的大小，但PGE2可以恢復被COX抑制劑所抑制的子宮的蛻膜化過程。有研究者發現Ptger2-/-小鼠雖然可以正常著床，但著床的位點數量明顯減少。這可能由于Ptger2-/-小鼠中PGE2與其受體偶聯，通過Gs激活腺苷酸環化酶，彌補了由于PTGER2缺失引起的cAMP不足。

而本研究中，PTGER2在子宮內膜崩解脫落期，mRNA的水平在除孕酮撤退的24 h之外，均無顯著性變化。進一步研究發現其蛋白水平在此過程中并無顯著性變化。同時免疫組化的結果顯示，PTGER2在子宮內膜崩解剝脫的進程中，在子宮中的分布并沒有顯著的區域性特征。PGE2的含量在崩解期特別是子宮內膜崩解關鍵期顯著增加，然而其受體PTGER2無論在mRNA還是蛋白質水平并無顯著變化，這提示PGE2對子宮內膜崩解剝脫可能通過PGE2含量的增加來實現，而不是通過其受體PTGER2表達的增加來實現。

我們發現Ptger2 mRNA在孕酮撤退的24 h表達顯著升高，此時子宮內膜完全脫落，新的腔上皮細胞已經被覆完全，修復啟動，提示這可能與崩解后的脫落有緊密關系，而此時的蛋白質并未出現此種情況，考慮mRNA翻譯到蛋白質具有一定的時間差。在本研究中并未對其后的24 h PTGER2蛋白質進行檢測，在后續的實驗中將進一步研究，以探討PGE2及其受體PTGER2對修復期子宮內膜的修復作用。

子宮內膜異常出血是影響女性生殖健康的重要因素。月經從青春期后開始出現，直到更年期結束，占據女性的一生中較長時間。月經期的身體健康，對女性生活質量影響重大。臨床上關于月經疾病的痛經、閉經和功能失調性子宮出血的發生機制并不明確。了解正常月經發生的作用機制，才能在臨床中找到治療靶點。