褪黑素保護卵母細胞應對熱應激損傷的研究

杜海燕，王守紅，黃薇薇

(內蒙古醫科大學第三附屬醫院 婦產科生殖醫學中心，包頭 014010)

哺乳動物具有在35～39℃的范圍內保持生理功能的能力，恒定的體溫對于生物體的正常生理功能十分重要。在持續高溫的情況下，動物的身體會對惡劣的環境做出一系列的生理和病理變化，如果溫度過高，身體的調節能力就會受到限制。當溫度高達41℃時，大多數動物都不能忍受這種壓力，生理功能會受到損害[1]。哺乳動物的生殖系統比其他身體部位對溫度更加敏感。大量研究表明，熱激刺激(heat stress，HS)對哺乳動物精子的生成、卵母細胞的成熟、早期胚胎的發育以及胎兒的生長發育有著嚴重影響。HS可以通過多種途徑導致卵母細胞的成熟障礙，可能影響顆粒細胞中類固醇激素(如LH)的合成[2]；HS能夠損傷體外成熟卵母細胞的染色體和細胞骨架，從而降低胚胎發育率[3]。另有研究表明，HS促使豬顆粒細胞凋亡，加速卵泡閉鎖，最終顯著降低排卵率[4]。隨著對凋亡相關基因caspase的抑制，HS對牛胚胎發育潛能的不良影響顯著降低[5]。在小鼠卵母細胞中，HS促使活性氧簇(ROS)水平過量表達，降低谷胱甘肽的含量，從而導致氧化應激反應的發生[6]。而氧化應激是危害細胞正常生理功能的最常見因素之一，導致細胞內結構的破壞，最終導致細胞死亡。抗氧化劑可以改善細胞的生存環境，減少HS對細胞的損傷。褪黑素(N-乙酰-5-甲氧基色胺)是最有效的氧化劑之一。褪黑素在卵母細胞成熟、排卵和早期胚胎發育等方面，起到重要的作用。研究結果顯示，褪黑素可以改善牛卵母細胞的質量，從而提高胚胎的發育率[7]，或許可以成為治療不孕癥的一種新的輔助藥物[8]。盡管許多研究已經報道了褪黑素對卵母細胞的體外成熟有促進作用，但是具體機制尚不清楚。本研究通過建立卵母細胞的HS模型，確定HS與卵母細胞成熟受損之間的潛在關系，再通過體外添加褪黑素，探討在HS下褪黑素促進卵母細胞成熟的作用機制。

材料與方法

一、實驗動物

8周齡ICR小鼠購于內蒙古大學SPF級實驗動物繁育室，飼養溫度22～24℃，濕度40%～60%，12 h光照/12 h黑暗交替，喂養滅菌營養顆粒飼料，自由采食飲水。本研究所涉及的動物實驗均遵照內蒙古醫科大學《實驗動物管理與使用操作規范》執行。

二、研究方法

1.卵母細胞的收集和體外成熟：使用成年8周齡ICR雌性小鼠，皮下注射10 U 孕馬血清促性腺激素(PMSG)，48 h后頸椎脫臼處死小鼠，取出卵巢扎破卵巢，取出卵丘-卵母細胞復合體，使用口徑合適的玻璃針反復吹吸去除卵丘細胞，置于CZB培養液(Sigma，美國)中，37℃、5%CO2培養箱中培養。2.5 h統計生發泡破裂(GVBD)比率，GVBD率=(發生GVBD的卵母細胞/全部卵母細胞)×100%；14 h統計第一極體排放(PBE)比率，PBE率=(排出第一極體的卵母細胞/全部卵母細胞)×100%。

2.熱激處理及藥物處理：將卵母細胞隨機分成3組，分別是對照組(Ctrl組)、熱激組(HS組)和熱激+褪黑素組(HS+M組)。褪黑素(Sigma，美國)濃度為1×10-9mol/L[9]。培養滴平衡過夜，對照組卵母細胞置入含2.5 μmol/L米力農(milrinone，Sigma，美國)的CZB培養液中使卵母細胞處于GV期，37℃、5%CO2培養10 h；將HS組卵母細胞和HS+M組卵母細胞置于含2.5 μmol/L米力農的CZB培養液中42℃、5%CO2培養箱熱應激10 h。隨后將3組卵母細胞同時在微滴中洗掉米力農轉入37℃、5%CO2培養箱中成熟培養。

3.紡錘體及染色體熒光染色：收集卵母細胞后，置于臺氏液中去除透明帶，4%PFA室溫固定30 min，0.5% Triton X-100中室溫通透1 h，1% BSA室溫封閉1 h；一抗anti-β-tubulin(Abcam，美國)1∶2 000，4℃孵育過夜；二抗FITC-Donkey Anti-Rabbit IgG(Jackson ImmunoRearch，美國)1∶1 000室溫避光孵育1 h，PI(Sigma，美國)1∶50復染，室溫10 min，封片共聚焦顯微鏡觀察，成像。

4.卵母細胞早期凋亡測定：細胞凋亡試劑盒購自南京建成生物工程研究所，按照操作說明書進行檢測。Binding buffer 和Annexin-V-FITC比例為10∶1，避光孵育10 min后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察、統計并拍照，卵母細胞早期凋亡即卵母細胞膜上存在綠色熒光信號，凋亡率=(存在熒光信號的卵母細胞/全部卵母細胞)×100%。

5.蛋白印跡法檢測熱休克蛋白70：將收集的卵母細胞加入13 μl裂解液(Bio-rad，美國)后的蛋白樣品煮沸5 min，上樣于12%的分離膠，電泳恒電壓120V，150 min。運用濕轉裝置，恒電流200 mA，轉膜1 h。5%脫脂奶粉封閉2 h。選取目的蛋白的條帶位置，分別孵育一抗Anti-Hsp70(Abcam，美國)、Anti-β-tubulin(Abcam，美國)1∶500，4℃過夜孵育。二抗Perox-AffiniPure Dnk Anti-Rabbit IgG(Jackson ImmunoRearch，美國)1∶2 000，37℃，1 h。孵育HRP化學發光底物(Pierce，美國)ECL檢測，成像。

三、統計學分析

結 果

一、褪黑素促進熱激后卵母細胞的成熟

通過對卵母細胞進行熱激處理，并在熱激后添加褪黑素體外培養14 h后進行統計。結果表明，與對照組相比，HS組卵母細胞GVBD率與PBE率顯著降低(P<0.01)；當在熱激后的卵母細胞培養液中添加褪黑素后，與熱激組相比，GVBD率(P<0.05)與PBE率(P<0.01)均顯著提高，但是仍顯著低于對照組(P<0.01)(表1、圖1)。

表1 褪黑素對熱激后卵母細胞成熟的影響(±s)

注：與對照組比較，*P<0.01；與HS組比較，#P<0.05，?P<0.01

標尺=100 μm圖1 不同處理組卵母細胞成熟狀況

二、褪黑素改善熱激后卵母細胞的紡錘體異常

為了研究褪黑素是如何改善卵母細胞的質量，我們通過免疫熒光染色觀察了紡錘體微管情況，發現與對照組相比，熱激后的卵母細胞發生了紡錘體的組裝異常，從而導致無法使染色體正確排列到赤道板(圖2)。通過統計異常的紡錘體的數量，發現與對照組相比，HS組異常紡錘體的比率有顯著提高(P<0.01)；當添加褪黑素后，一定程度的改善了紡錘體裝配異常，與HS組相比差異顯著(P<0.01)，但是并沒有恢復到對照組水平(P<0.01)(表2)。

三、褪黑素減少熱激后卵母細胞早期凋亡

卵母細胞的早期凋亡情況結果表明，通過熱激處理的卵母細胞與對照組相比，顯著提高了細胞的凋亡率(P<0.01)；在添加褪黑素后，能夠在一定程度上降低HS所致細胞凋亡(P<0.01)(表3、圖3)。

紅色：染色體；綠色：紡錘體；標尺=20 μm圖2 不同處理組MII卵母細胞紡錘體狀況(染色體復合體免疫熒光染色)

表2 褪黑素對熱激后卵母細胞紡錘體異常率的影響(±s)

注：與對照組比較，*P<0.01；與HS組比較，#P<0.01

表3 褪黑素對熱激后卵母細胞早期凋亡的影響(±s)

注：與對照組比較，*P<0.01；與HS組比較，#P<0.01

早期凋亡的信號為卵母細胞膜上的綠色熒光圖3 不同處理組MII卵母細胞的早期凋亡狀況

四、褪黑素通過HSP70的過表達改善卵母細胞質量

為了研究褪黑素是通過何種機制來改善卵母細胞，我們檢測了卵母細胞中熱休克蛋白70(HSP70)的表達水平。結果顯示，熱激后導致HSP70蛋白表達量有所上調，但與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)；添加褪黑素導致HSP70蛋白表達量與對照組和HS組相比顯著提高(P<0.01)(圖4)。

與其他兩組比較，*P<0.01圖4 不同處理組卵母細胞HSP70蛋白表達情況

討 論

熱激會導致動物生殖系統的氧化損傷，引起細胞功能紊亂，導致細胞凋亡。例如，高溫能顯著誘導豬卵巢濾泡和顆粒細胞凋亡[10]。人工授精22 h后暴露于42℃持續9 h，造成豬胚胎發育異常[11]。本研究結果表明，HS能顯著的影響卵母細胞的GVBD率和第一極體排放率，這與前人的研究結果一致，HS影響卵母細胞的成熟，進而影響胚胎的發育潛能[12]。通過免疫熒光染色，發現HS能夠影響在卵母細胞成熟過程中微管的組裝，從而使卵母細胞無法正常排出第一極體。本研究還檢測了卵母細胞的早期凋亡，發現HS會顯著增加卵母細胞早期凋亡的比率，通過添加褪黑素有效地降低了早期凋亡的比率，但是沒有恢復到對照組水平。

褪黑素是一種有效的抗氧化劑，褪黑素及代謝產物N1-乙酰基-N2-甲氧基尿胺和N1-乙酰基-5-甲氧基尿胺可以直接清除活性氧，刺激抗氧化酶的產生。此外，褪黑素可以通過螯合過渡金屬從而減少羥基自由基的形成，因此，褪黑素可能通過這種機制改善了熱應急帶來的卵母細胞的成熟障礙。除此以外，有研究表明，HSP70是一種維持細胞內穩定環境和抑制細胞凋亡的多因素作用因子[13]。HSP70通過調節caspase-3和細胞色素C，保護細胞免受凋亡的影響，并在凋亡調控網絡的下游發揮作用。高水平的HSP70通過上調SPKH1、BCL-2、SOD1、CAT和CPX4而下調p53，從而幫助卵母細胞存活[14-16]。因此，通過我們的檢測結果表明，褪黑素能夠改善卵母細胞的質量，可能是通過HSP70的表達上調來保護卵母細胞。

總之，在體外培養條件下，HS會影響卵母細胞的成熟。這可能是由于氧化應激和干擾激素產生引起的，反過來，這又導致了核成熟和細胞周期的停滯。此外，HS可能通過抑制線粒體的正常功能，導致卵母細胞成熟障礙，甚至發生早期凋亡。褪黑素可通過消除ROS和調節類固醇激素的產生而顯著促進卵母細胞的成熟[17]。更重要的是，褪黑激素保護線粒體免受應激損傷帶來的早期凋亡[18]。此外，卵母細胞可能有一種自我防御機制來提高內源性褪黑激素的產生來改變HSP70的表達。所有這些機制都有助于卵母細胞對抗HS。